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liusu05

铁虫 (初入文坛)

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[交流] WB实验总做不好，那么如何进行WB实验质控呢？已有2人参与

做过WB实验的小伙伴都经历过成像时忐忑不安，出来结果时的彷徨无措，为什么条带没有出啦，为什么背景这么高，为什么受伤的总是我，看着旁边小伙伴漂亮的结果图，心生羡慕嫉妒，那么小编给大家整理总结了如何进行WB的质控和注意哪些检查点。
蛋白样品：
准备好裂解液后，使用BCA或Bradford等检测方法仔细测量蛋白浓度。进行上样时，确保加入等量的蛋白样品，以确保公平比较，从而最大限度地减少上样误差。不要使凝胶过载！如果您的表达目标非常低，可选择加样孔体积大的凝胶，这样可提高上样量。
阳性和阴性对照：
这些质控对于证明您的结果有效至关重要。阳性对照通常是裂解物或组织提取物，其具有过度表达的蛋白。当您的阳性对照未能发出信号时，您知道该方法可能存在问题。如果您正在使用重组蛋白，那么包含内源形式靶标的阳性对照也是一个好主意。这将有助于理清与一抗相关的任何特异性问题。阴性对照同样也有价值，通常是不会产生目标的裂解物或组织提取物。最好的阴性对照由敲除或未处理的细胞系制备。
内参对照：
有几种广泛可用的上样对照抗体，如GAPDH，actin 或 tubulin。由于这些蛋白表达丰度高，因此在适应低丰度目标的样品表达看到内参对照蛋白的过饱非常常见。这里最大的挑战是内参对照和靶蛋白在相同的样品稀释系列中通常具有不同的线性，影响定量的准确性，对于目的蛋白表达比较低的蛋白，可选择低表达的内参例如Lamin B1和HSP60等蛋白。此外，研究人员需要证明内参蛋白的表达不会因实验条件的变化而改变。

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