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charon1982

铁杆木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by sunjiali2005 at 2009-6-6 12:11:
kan+在原核生物(大肠杆菌)不表达,所以没有kan抗性,T载体一般是amp抗性

谁告诉你不表达的啊,你查查pET29a的抗性是什么
帮助虫友,提升自己
11楼2009-06-08 12:34:06
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charon1982

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by smurfen at 2009-6-7 09:27:
楼主的kanr可以扩出来,引物设计肯定没有问题吧
pET28a是原核表达的载体,它上面的卡那在大肠杆菌中肯定有抗性
楼主直接连接T载体,和酶切位点的选择又没有关系了
是不是直接把连接产物转化菌落用kan筛选?
有 ...

补充一点,TA克隆是有方向性的,要测序的,看看你的TA克隆是不是正向!
帮助虫友,提升自己
12楼2009-06-08 12:37:24
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L84429

金虫 (小有名气)

继续努力呀,坚持不懈就能胜利
13楼2009-06-08 12:49:09
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kunzheng15

至尊木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
不要用PET28,这个载体的问题很多,我用28蛋白不表达。。。。
14楼2009-06-08 15:47:30
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Yuri2682

新虫 (初入文坛)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by kunzheng15 at 2009-6-8 15:47:
不要用PET28,这个载体的问题很多,我用28蛋白不表达。。。。

真的?
15楼2009-06-08 20:09:22
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jqq1985

银虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
单有基因没有用的,你有没有将KAN的上游启动子序列和下游终止子序列一起扩出来呢》?如果把整个基因所有元件一并阔出来连到载体上才有抗性能力。并且不需要验证插入的方向。

[ Last edited by jqq1985 on 2009-6-9 at 12:54 ]
16楼2009-06-09 12:52:21
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haylig

铜虫 (小有名气)

我就是按照楼上说的,扩增包括启动子和终止子和结构基因的卡那抗性,之前我构建的一个敲除载体就是用卡那作为筛选的。技术流程是:目的片断连T载体--扩增还酶切位点的卡那抗性--单酶切目的片断和卡那抗性--酶切产物连接--构建成功--达到破坏目的基因的效果--电击转化目的菌,为什么很多虫友都说连在T载体上不表达卡那抗性那。现在这个载体构建遇到的问题是卡那抗性和连在T载体上的目的片段单酶切后连不上,不知道是抗性片断的问题还是目的片断,如果没切充分,应该连接效率不高,但是总会有连上的,呵呵,谢谢大家的讨论,受益非浅。
17楼2009-06-09 20:47:08
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haylig

铜虫 (小有名气)

还有个问题:扩出来的片断如果在-20保存2周,A尾巴会掉吗,连不到T载体上,有这样的说法吗,有经验的说说。
18楼2009-06-09 20:50:30
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dyyyyy

铁杆木虫 (著名写手)

是不是启动子的问题呀,你克隆的片段也没有带原核启动子呀?
19楼2009-06-10 07:57:12
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haylig

铜虫 (小有名气)

我又做了几次T载体连接卡那抗性基因的实验,还是不能在卡那的平板上长,30和50的卡那浓度都试过了,让别的分子高手也操作过两次,就是不长,真的很晕,怎么回事呀,大家帮帮忙,我连T载的目的是要把它切下来连接别的东西,之前卡那抗性片断酶切老是连不上,现在想的先连接T载体,切开没有可以看到,现在连T载体都连不上,下一步根本做不了,太郁闷了
20楼2009-06-19 09:46:49
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