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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 卡那抗性基因老扩不出来，大家出出注意
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charon1982

铁杆木虫 (著名写手)
★
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Originally posted by sunjiali2005 at 2009-6-6 12:11:
kan+在原核生物（大肠杆菌）不表达，所以没有kan抗性，T载体一般是amp抗性

谁告诉你不表达的啊，你查查pET29a的抗性是什么
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帮助虫友，提升自己
11楼2009-06-08 12:34:06
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charon1982

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by smurfen at 2009-6-7 09:27:
楼主的kanr可以扩出来，引物设计肯定没有问题吧
pET28a是原核表达的载体，它上面的卡那在大肠杆菌中肯定有抗性
楼主直接连接T载体，和酶切位点的选择又没有关系了
是不是直接把连接产物转化菌落用kan筛选？
有 ...

补充一点，TA克隆是有方向性的，要测序的，看看你的TA克隆是不是正向！
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帮助虫友，提升自己
12楼2009-06-08 12:37:24
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L84429

金虫 (小有名气)
继续努力呀，坚持不懈就能胜利
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13楼2009-06-08 12:49:09
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kunzheng15

至尊木虫 (正式写手)
★
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不要用PET28，这个载体的问题很多，我用28蛋白不表达。。。。
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14楼2009-06-08 15:47:30
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Yuri2682

新虫 (初入文坛)
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Originally posted by kunzheng15 at 2009-6-8 15:47:
不要用PET28，这个载体的问题很多，我用28蛋白不表达。。。。

真的？
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15楼2009-06-08 20:09:22
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jqq1985

银虫 (正式写手)
★
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单有基因没有用的，你有没有将KAN的上游启动子序列和下游终止子序列一起扩出来呢》？如果把整个基因所有元件一并阔出来连到载体上才有抗性能力。并且不需要验证插入的方向。

[ Last edited by jqq1985 on 2009-6-9 at 12:54 ]
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16楼2009-06-09 12:52:21
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haylig

铜虫 (小有名气)
我就是按照楼上说的，扩增包括启动子和终止子和结构基因的卡那抗性，之前我构建的一个敲除载体就是用卡那作为筛选的。技术流程是：目的片断连T载体－－扩增还酶切位点的卡那抗性－－单酶切目的片断和卡那抗性－－酶切产物连接－－构建成功－－达到破坏目的基因的效果－－电击转化目的菌，为什么很多虫友都说连在T载体上不表达卡那抗性那。现在这个载体构建遇到的问题是卡那抗性和连在T载体上的目的片段单酶切后连不上，不知道是抗性片断的问题还是目的片断，如果没切充分，应该连接效率不高，但是总会有连上的，呵呵，谢谢大家的讨论，受益非浅。
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17楼2009-06-09 20:47:08
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haylig

铜虫 (小有名气)
还有个问题：扩出来的片断如果在－20保存2周，A尾巴会掉吗，连不到T载体上，有这样的说法吗，有经验的说说。
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18楼2009-06-09 20:50:30
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dyyyyy

铁杆木虫 (著名写手)
是不是启动子的问题呀，你克隆的片段也没有带原核启动子呀？
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19楼2009-06-10 07:57:12
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haylig

铜虫 (小有名气)
我又做了几次T载体连接卡那抗性基因的实验，还是不能在卡那的平板上长，30和50的卡那浓度都试过了，让别的分子高手也操作过两次，就是不长，真的很晕，怎么回事呀，大家帮帮忙，我连T载的目的是要把它切下来连接别的东西，之前卡那抗性片断酶切老是连不上，现在想的先连接T载体，切开没有可以看到，现在连T载体都连不上，下一步根本做不了，太郁闷了
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20楼2009-06-19 09:46:49
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