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革兰氏阴性菌的电转化感受态怎么制备？
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我在做电击转化一个3000bp的片断到我的菌（革兰氏阴性细菌）进行同源臂交换重组，电转了几次都没成功，已经一个多月了没有进展，在卡那的平板上筛选，要么是空白也长，要么什么都不长，反正挑了很多都是假阳性，我的感受态细胞是这样制的，大家帮我看看，有什么问题。 电击转化目的片段实验步骤： 1． 制备含卡那50mg/l和山梨醇0.25mol/l的普通平板培养基。 2． 种子培养菌到14h（同产我的菌种子要培养18h），通过测定OD，确定OD=1，再按照1％接种二级培养3h，到OD=0.5-0.7之间时取样50ml，取样后在冰中放置15min；4℃,3000rmp离心10min，收集菌体；沉淀分别以等体积冰浴无菌超纯水洗涤两次，然后以0.5M的冷山梨醇溶液洗涤两次，最后用200µl0.5M的山梨醇溶液重悬，-70℃保存，即为感受态。 3． 将ntrc-kana片断10µl(1µg)和200µl、100µl感受态细胞混合,冰上放置10 min。Eppendorf多功能细胞穿孔仪2000V,，5ms，电击1次进行转化。在含50μg/mL卡那霉素和0.25M山梨醇的普通平板培养基上筛选阳性重组菌落。 4． 电转杯要在酒精里泡24h，用无菌水洗涤多次后在超净台吹干即可用。 5． 电击后直接加入1ml种子培养基，在30度培养2h后涂布含卡那的平板，按照本细菌培养条件培养。 还有不明白为什么洗涤时每次加入的量要递减？ 谢谢大家的帮助。 |
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