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求植物核蛋白提取方法，非常感谢！ 发自小木虫Android客户端 |
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wanghm200810
铁虫 (小有名气)
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- 专业: 生物大分子结构与功能
【答案】应助回帖
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invent PF-045 MinuteTM植物胞质胞核分离试剂盒 描述： 本试剂盒用于新鲜或冷冻的柔软植物组织进行细胞组分分离。与其他商用试剂盒以及实验室常用方法不同，不需要大量起始材料（几克）和较长时间的。本试剂盒仅使用100-200毫克的起始材料，通过使用离心管柱技术配合特有专用缓冲系统，1小时左右可将样品分离成胞浆、细胞核、叶绿体和细胞器四个组分。分离的组分可用于多种应用，包括但不限于蛋白质转运研究、核蛋白提取和核酸纯化/测序。分离出的高纯度核可用于蛋白质组学、流式细胞术分析、DNA测序、蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA相互作用研究。分离原理：研磨组织以释放植物细胞，然后快速通过离心管柱破坏细胞膜，通过差速离心得到不同的细胞组分。只需使用台式离心机即可。该试剂盒已被验证用于许多物种，如拟南芥、菠菜、豌豆和油菜等。 试剂盒组分（20次） 1. 缓冲液A 30ml 2. 缓冲液B 1ml 3. 缓冲液C 25ml 4. 离心管柱和收集管 20套 5. 1.5ml离心管专用研磨杵 2根 6. 研磨粉 2g 所需附加材料（试剂盒中未提供） 4℃台式离心机（10s内可以升速至16000Xg） 1XPBS 1 X PBS with 5% BSA (流式实验时准备) 1.5ml离心管 运输 及 储存 常温运输， 4度 储存 操作方法： 注意：开始前仔细阅读整个操作说明。建议在使用前将蛋白酶抑制剂加在缓冲液A和PBS中（蛋白酶抑制剂终浓度为1X，例100X蛋白酶抑制剂，1mlA液中加10ul蛋白酶抑制剂）。本试剂盒操作体系最低可降至50mg起始样本。缓冲液A和缓冲液B使用前需冰上预冷。 1. 将 100-150mg新鲜 /冷冻的植物嫩叶加到 离心管柱 套管中， 翻动按压叶片将其塞入到离心管柱中。加 入 100ul缓冲液 A，用 200ul吸头 按压叶片 100-200次以压缩叶片体积（此步大概需要 2-3min）。 2. 用研磨棒 的 平头端 用力按压研磨 100-200次（大约 2-3min）。 注意：研磨棒 可重复使用，用 70%酒精擦 拭或用蒸馏水冲洗干净 ，用纸巾擦干 。 3. 再加 300ul缓冲液 A到离心柱 中 ，用 200ul吸头 将样品 搅拌 混匀 。盖上盖子， 1500Xg离心 5min，弃去离 心管柱。 可选优化：离心后 将 接收管中 200ul上清转回离心管柱上重复研磨， 可 增加 最终 产量 。 如需 分离胞浆 及微粒体组分 收集管中的 上清转移到一个新的 1.5ml EP管中放到冰上 备用 （不分离可弃掉 沉淀用 1ml预冷的 PBS吹打重悬，然后 1200Xg离心 5min。弃掉上清，加入 1ml缓冲液 A吹打重悬沉 淀，同时添加 20ul缓冲液 B 大力 振荡 10-20s。确定沉淀完全复溶。 以下操作步骤根据实验需求选择，如需分离胞浆及微粒体组分，从4A步骤开始，如仅需细胞核组分，从4B步骤开始。 4A分离细胞浆和微粒体组分： 第 3步所得上清 4000Xg离心 10min 沉淀 主要 为 破碎的叶绿体 ）。将上清转移到一个新的 1.5ml EP管中 16000Xg离心 30min。（ 上清是胞浆组分，沉淀是 已经去除大部分细胞核及叶绿体的 微粒体组分 即：细胞 器和质膜组分 4B 分离细胞核 : 将第 3步重悬 的沉淀在冰上孵育 5min 1200Xg离心 5min。完全去除上清 ，沉淀用 200ul预冷的 PBS移 液 器上下吹打 30-40次 重悬 。 将 1.2ml缓冲液 C加到 一个 新的 1.5ml EP管中 将前面 PBS重悬的沉淀用 移液器 小心 贴着管壁缓慢 吹出到 C液上方 1200Xg，离心 5min 离心后 清晰可见 一个白色 或 浅绿色沉淀 以及 绿色上清。将上清完全去除干净，用 0.5ml预冷 PBS清洗沉淀（ 沉淀为 分离的 完整 细胞核 ）。细胞核 可以根据下游实验复溶在合适的溶解液中。例如：蛋白抽提实验，可以将核用 50-100ul溶解液裂解 ，得到 的蛋白可以进行 WB检测， ELISA或者 IP（详见下表以及技术说明 。测定蛋白浓度，推荐使用 BCA法。 如果下游是做流式检测分析可以用 0.2-0.5ml含 5%BSA 的 PBS重悬细胞核。核酸提取，可用 Tris缓冲液 或者其他合适的细胞核缓冲液 重悬 。 技术说明 1. 虽然这种试剂盒对幼嫩的植物叶片最有效，但也适用于其他软组织，如种子、外壳和软茎。对于非叶 片 软组织，将其切割成 1 x 1 mm或更小的碎片， 按照操作步骤进行即可 。非叶 片 组织 获取的细胞核 的纯度 通常 不如叶 片 组织。在大多数情况下，主要污染物是质体 plastids 而不是叶绿体。 2. 如果分离的细胞核 有明显的 绿色 ，用 0.5ml PBS加 20ul缓冲液 B重悬细胞核，冰上孵育 10min 1000Xg离心 5min收集清洗过的细胞核。 3. 说明书中 样品 起始量对于大多数样品而言得率是 足够的。样品不要超过 200mg 并非样品越多结果越好。 4. 从分离的细胞核沉淀中提取蛋白， 如使用 W A 009 溶解 液（参照下面表格），加入 50ul 蛋白 溶解 液 后， 需 加 入 40 50mg 试剂盒中提供的 蛋白分离粉到管底部 用 试剂盒中 研磨棒 尖头端 用力研磨 100 200 次。 再补加 50ul WA 009 溶解液 8000xg 离心 5min ，上清为 分离出来的核蛋白 溶液 。蛋白得率通常在 20 50ug/ 样品。如果需要更多的蛋白 ，可将多管 分离的核 合并在一起再提取蛋白 即可。 |
2楼2019-09-09 17:16:02
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