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再见苏摩

银虫 (初入文坛)

[交流] 要崩溃了。。。。DNA基因组提取问题

已经做过几次DNA提取了,但是都没有 结果,用蛋白酶k处理过夜后,buffer都没有变粘稠

我的具体步骤:

材料:草鱼肝脏组织和肌肉组织,-80度保存

消化液配方:
100mM NaCl
10mM Tris-Cl,(PH=8)
25mM EDTA,PH=8
0.5% SDS
0.1mg/ml 蛋白酶K

取100mg组织,用剪刀剪碎,用1.2ml组织液55度过夜处理

过夜后,组织已经降解,但buffer没有粘稠,用酚氯仿抽提过一次,没有东西,能帮我分析分析吗?

已经重新配过几次试剂了,都是一样,已经不知道该怎么搞了,郁闷
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DLLB

金虫 (小有名气)

提基因组还是用试剂盒吧,我用酚氯仿抽提抽提就没成功
2楼2009-06-01 21:06:33
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再见苏摩

银虫 (初入文坛)

先不说抽提,为什么释放基因组这一步我始终没东西啊,郁闷死了
3楼2009-06-02 08:43:18
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tangtl

木虫 (正式写手)

小木虫潜水者

我用试剂盒提出来效果也不好。手工提成功率更低。
4楼2009-06-02 08:46:38
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weiwei1

木虫 (小有名气)

组织要研磨吧,不能光剪碎。
5楼2009-06-02 08:52:40
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charlies929

至尊木虫 (正式写手)


再见苏摩(金币+1,VIP+0): 6-2 14:25
我觉得1. 组织处理不够,还是需要先研磨的2. 基因组提取还是使用Kit吧,我们实验室用MN的还蛮好用的,价格也不贵。
6楼2009-06-02 09:17:26
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再见苏摩

银虫 (初入文坛)

问楼上的,MN是什么牌子
另,天根的提基因组的KIT怎么样,有人用过吗
7楼2009-06-02 10:46:47
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)


再见苏摩(金币+1,VIP+0): 6-2 14:29
你提的gDNA用于做什么实验?
很普通的实验,用国产的天根就够了
如果需要很严格,用QIAGEN的吧
8楼2009-06-02 10:49:30
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

★ ★
再见苏摩(金币+2,VIP+0): 6-2 14:25
我做相关实验过夜用37℃,55℃蛋白酶K会不会变性失活?
消化液配置过程中,各组分为分开灭菌吗?(即是否有过高温过程让蛋白酶K失活,配蛋白酶母液是灭菌水也不能超多40℃。)
不研磨,直接减碎也可以,但是最好用小的眼科剪刀,你100mg的量至少剪上半个小时吧。
过夜前,用牙签将组织和消化液混匀,消化其间最好上下颠倒下。
抽提后就能够出东西吗?我记得还需要用冰乙醇(-20℃至少放置4h)让基因组DNA变性才能够析出吧,因为基因组DNA是会溶解于水层的。
Thank-you,so-blue.
9楼2009-06-02 11:08:47
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再见苏摩

银虫 (初入文坛)

Tris·Cl我用的别人的,这是我几次配试剂都没变过的东西,决定自己重新配一次
组织预处理改成液氮碾磨
重新再做一次试试,不行的话我就只有买试剂盒了。。。。
10楼2009-06-02 14:28:43
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