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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 细胞科学 » 求助构建shRNA敲除载体遇到问题
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shnmyx

铜虫 (正式写手)
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求助构建shRNA敲除载体遇到问题
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本人第一次做分子实验，从设计shRNA，构建shRNA敲除载体开始，现在已经构建好，开始验证是否构建正确，遇到如下问题，想请教路过的各位大神，谢谢。
问题1: 将构建好的质粒转化大肠杆菌，从同一个板上挑了三个转化子摇菌，分别提取质粒，经跑胶验证质粒是否提出来，大小是否一致，结果发现三个质粒不是同一个大小，有人遇到过这种情况吗？是什么原因呢？是我构的质粒有问题还是这种本身就会出现假阳性克隆？
问题2：为了验证酶切空载质粒回收这一步是否正确，有人建议将酶切回收后的这段序列进行转化铺板，如果板上不长菌就说明酶切空载这步是正确的，但是结果是长了，我当时觉得我的质粒加多了，正常的别人质粒浓度1000ng/ul，只加1ul，我当时加了4ul，会不会部分没有切成功，导致回收的片段中还有完整质粒存在，这样做能说明质粒没切成功吗？大家一般会这样做来验证吗？
问题3：如果排除前面的问题，我最后构建的符合我要的发大小的质粒，做了双酶切验证，发现都是符合我的要求的，唯一就是问题2中出现的问题，如果没长就确定我构建成功，但是现在长了，是否证明我没有构建成功？

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1楼 2019-08-17 09:59:52
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rohdy

新虫 (著名写手)
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提了质粒酶切条带大小正确的拿去测序就好了，没必要做太多验证

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17楼2019-08-17 10:54:43
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shnmyx

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by rohdy at 2019-08-17 10:54:43
提了质粒酶切条带大小正确的拿去测序就好了，没必要做太多验证

老师不让测序

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23楼2019-08-17 16:05:52
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rohdy

新虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
23楼: Originally posted by shnmyx at 2019-08-17 16:05:52
老师不让测序
...

不测序你没法证明序列正确呀，要么你就直接转细胞做PCR或WB确认下目的mRNA和蛋白表达降低了

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24楼2019-08-17 16:20:44
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zfpd27662楼
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pandongzi3楼
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hdchina20104楼
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zhulei03247楼
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weizhe349楼
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dzxylxm10楼
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yuying042111楼
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泽林 冷Z12楼
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?W痕14楼
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CL2014化生15楼
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rohdy16楼
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youngbyn18楼
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shilidawei19楼
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tzynew21楼
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nadp16322楼
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