关于无缝克隆的问题 - 分子生物 - PCR相关 - 第2页小木虫论坛-学术科研互动平台

11楼2020-05-22 14:38:07

soarshining

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9楼: Originally posted by 成事想心 at 2019-09-19 10:06:18
目前也在用同源臂做一步克隆，目前有以下几个问题：1.重组液用引物可以跑出目标条带，但是转入DH5α后涂平板可以长出单菌落，但是PCR不出目标条带；2.涂抗生素的对照平板上面也长出来菌。已经做了一个月了，希望做相 ...

也遇到过类似问题，真的感觉诺唯赞的东西在国产里算好的，但还是很玄学。有时候一次成功，有时候一两个月死活连不上。

12楼2020-05-27 22:46:21

soarshining

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4楼: Originally posted by 学而不思则惘 at 2019-08-15 09:59:15
是啊我怎么知道老师的想法呢，我只是个研一的说让干啥就干啥
...

价钱不一样吧。。。。。老板想的是一次成功的价钱，如果全部一次成功，那确实便宜很多哦

13楼2020-05-27 22:48:13

soarshining

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不知道你卡在哪一步？过了这么久解决没？先写一些自己的经验，也希望楼主能分享分享实验经验，我也对诺唯赞的无缝克隆头疼。

我用无缝克隆做缺失突变和插入突变，发现这个实验对引物要求相当高，因为需要两头互补，引物5`端会有几个碱基是和模板配不上的，一般我是两头各8个。这样还得保证引物除去这8个后的部分tm值要达到60℃以上，就不得不很长，遇到a/t比较多的有时候引物得有45个bp，这样的引物特别容易错配，有时候pcr都能卡你个把月才p出特异性好的条带。我还遇到过pcr 条带特异但是大小不对，最后发现除了需要的片段还多了很多，说明有一头的引物“特异”的发生错配。所以你每次连接理论都需要单克隆测序验证过然后继续往下连。虽然有所谓一次性好几个片段的，但是运气不好就会出问题，就是因为引物特异性没法保证。

另外我发现不同序列，对于这个15-21的要求也是不一样的，遇到过死活连不上然后把互补从16个变成20个然后连上的，也遇到过把互补区域挪移，变成上游留4个下游留12个然后就连起来的。真的挺玄学的。其实就是这个连接过程更深的东西没有研究透吧。

总的来说其实关键就是引物设计，不同长度互补区，断口在互补区域的位置，引物的特异性等等都有影响。

还有，说明书虽然说他家的pcrmix可以直接加入dpni消化模板，但还是建议做pcr回收再消化。有时候会得到模板假阳性。

此外，消化完了建议通过胶回收把目的片段纯化然后进行环化。pcr回收可能都不够，因为本身这个引物因为需要5`端有一段悬挂片段，容易出现非特异扩增，所以你进行重组环化的时候，用260/280测得浓度不准，跑胶用条带亮度去比的结果也不准，加进去的两个片段浓度就不是最适合的，这也影响连接的效率。做了胶回收，然后再重新跑胶通过条带亮度结合标曲去定量，这样子的结果才靠谱。有钱的话买那种定量用的荧光染料去曝光做标曲。

其他暂时没有了，转化连接产物尽量带上不加酶环化的阴性对照避免假阳性。

ps，无缝克隆，也有叫gibson assemble clone或者infusion clone。

14楼2020-05-27 23:16:54