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来自冷泉港的蛋白纯化经验（两周培训=$2600学费）已有51人参与
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最近正在做蛋白表达纯化，偶然的机会在丁香园看到这个帖子，很受启发。转发过来与虫友们分享。希望对大家有所帮助。 文中提到的几本书我手里没有，希望有书的虫友能够与大家共享一下。 为了满足一些懒虫的需要（全文都在此，但还是要劳驾copy&paste），帖子末端附加全文下载链接。（为使链接长期有效，所以没使用纳米盘）。 附件文档除《从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记》外，添加了Royluo的《生命之初---CSH小鼠分子胚胎课侧记》，是从网上搜集的，供感兴趣的虫友参考。 ---------------------------------------------------------------------------------------------- 从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记 Royluo 本文献给YL 引子 2000年5月6日，我一个人在合肥三孝口书店闲诳,希望买点参考书带出国去。我注意到有一本翻译过来的书，书名叫做《蛋白质纯化与鉴定实验指南》。这本书很奇怪，里面列出了很多具体实验的步骤和解释。我很快意识到，这本书实际上是冷泉港实验室开设的一门《蛋白质纯化与鉴定》实验课的教材。这本书深深的吸引了我，因为里面记录的实验十分经典，涵盖了蛋白质纯化中可能用到的大部分手段，并且对实验细节有十分详尽的解释。我对这本书爱不释手，于是就买了下来, 而且当时就动了上这门课的念头。这是一个很模糊的想法，没有想到的是，五年以后这个想法竟然实现了。 这一系列文章是我对这次上课经历的全面总结，一部分是八卦，一部分是流水账般的记叙，还有一些是从这课程学到的tricks, 最后也掺杂着自己过去做蛋白质纯化的心得。想到哪说到哪，文字挺松散的，见笑了。 我来解释一下标题。课程结束之后，每一个学员都有一份证书，印着Per Pura Ad Astra 几个大字。这是拉丁语，直译就是“从纯化到星辰”。原始的谚语是,Per Aspera Ad Astra, 意思是through suffering torenown。所以“从纯化到星辰”实际的意思是，做好蛋白质纯化，以后就容易出人头地。呵呵。 （二）同学和老师 冷泉港的《蛋白质纯化与鉴定》培训班历史相当悠久，从1989年开始每年都开课，到今年是第十六次。每年都是四月初开始，持续两个星期。值得一提的是，冷泉港有相当多的培训班和会议，是一个科学家交流和学习的中心。这是冷泉港享有盛名的最主要原因。 2004年底, 我下定决心上这门课，于是递交了申请。二月份的时候的到消息，我被录取了，并且还有1000刀的tuition waiver。可我还是高兴不起来，因为还得解决1600刀(学费一共2600刀)。老板人很nice,但是他实在没钱了，所以我只好咬咬牙自己套腰包解决了，去年的退税就这样全搭进去了, 欲哭无泪啊。 四月五号下午我赶到冷泉港，办完登记手续后被告知晚上七点全体开会，与教员和同学见面。老师一共有四个，每人负责一个模块的实验，持续三天时间, 每个老师都有一两个助手帮忙。学生则一共有16个，分成四组，轮转式的做完四个模块。我这一组其他三个人是:来自colorado Boulder 的chad,做有丝分裂的;来自Princeton的Adam,做海洋生物学的。Chad和Adam都是博士后。第三个是来自丹麦的Charlotte，是个博士生，做植物的。 现在开始八卦一下几个老师，^_^ 总负责人是来自wisconsin-madison的Richard Burgess教授, 这老头很有意思，带这个培训班已经带了十二年了，到现在还是乐此不疲。他六十年代是watson的博士后，watson似乎跟他关系很好，每年纯化课的时候，watson都会跑到培训班的实验室找Burgess聊天，同时拉他去吃饭什么的。后来的有一天，我还真的看到了watson去找他聊天。不过令人惊讶的是，watson此人相当精神，走路象年轻人。watson此人口碑很不好，很自大。连Burgess教授一次和我们吃饭的时候都承认，watson有时候口无遮拦，让他都觉得很难堪。但是Burgess又承认watson对他自己的学生很支持，很提拔，这几年又尽心尽力为冷泉港筹 款，贡献巨大。 第二位教员是来自UCLA 的Albert Courey 教授。这位教授人很nice也很幽默，四位老师中我对他印象 最好。申请这个课前，我先跟他发过e-mail 询问这个课的情况，而他也鼓励我申请。这老哥研究果蝇的, 但是他却负责教一组纯化转录因子的实验。我一开始不太理解，后来问他的学术经历，才明白是怎么回事。原来这老哥博士是做生化，博后跟的是robert Tjian （钱泽南），还是做生化，研究转录因子。后来做了faculty之后，决定用果蝇做模型来研究转录因子。他那时侯不懂果蝇的遗传学，完全靠自学和到处问人。我知道后觉得特佩服，真正的科学家不应该被自己过去所受的训练束缚死了，应该是根据研究的需要随时准备学习新东西。这老哥虽然不是最年轻的，但是却很能跟上年轻人的潮流，比如他说他有一个ipod mini,还在网上itunes商店买过歌。我还跟他就ipod聊了一阵子，因为我也有个ipod。 第三位教员是来自Texas MD anderson cancer center的sue-hwa lin教授。她是一个身材瘦小的中年妇女，台湾人，特搞笑，非常喜欢给我们讲她博士后老板的笑话。一个笑话是这样的, 有一天有一个学生向这个老兄投诉说和实验室另一人有矛盾。这个老兄想了想，然后一本正经的说，和人产生矛盾了，一般有三种选择。第一种呢，就是既然你恨他，那就杀了他好了。那个学生听了之后，差点倒了。这个老兄说看起来你丫没这胆量，那还有第二种选择，就是杀了你自己。那个学生听了几乎要吐血。这老兄一看乐了，然后说你既然没种杀人或者自杀，就剩第三种选择了, 就是ignore that guy!!!哈。还有另一个笑话，sue-hwa lin的 博士后老板虽然当了老板，但是还是喜欢做实验，并且和一个博后共用一个bench。有一天那个博后指着这老兄的鼻子说，XXX呀，你把bench弄得太乱了，赶快给我清理干净了。这老兄听了之后也不怒，而是慢条斯理的辩解说，每个人都有自己喜欢的工作方式，我喜欢乱，你丫管我呢，要是不喜欢，我们可以在bench上画条线划清界线，从此井水不犯河水。哈哈哈。这老美连三八线都出来了。 第四位教授是rutgers university 的konstantin Severinov副教授，这老兄是俄罗斯人，这四位老师中最年轻的一位。此君满头乱发，一脸大胡子，看起来很邋遢，所以一开始我对他印象不佳。后来发现此人相当nice。Konstantin特搞，有一次他做报告，他的电脑的桌面上有一堆乱七八糟的文件夹，其中有一个竟然是divorce!我告诉坐我旁边的一个老美，老美说也注意到了，认为实在是很sad，呵呵。另外，他有两个未成年的儿子，喜欢不断打他手机。结果他常常讲实验讲到一半就得停下来接电话。这个课结束之后，他还跑到冷泉港书店买了一堆虫子毛绒玩具给两个儿子做纪念品。舔犊情深，可见一斑。 （三） 不溶的sigma32 四月六号早上，我们开始了第一模块的实验，Burgess教授负责。这老兄研究了一辈子E.Coli的RNA polymerase。E.Coli RNA polymerase 核心酶是一个蛋白质复合体，只有合成RNA的活性，却没有识别DNA的能力。Sigma系列因子能够识别启动子, 并且与核心酶结合，从而实现转录。我们这个实验 的核心主角就是其中一个因子，叫sigma32。Sigma32可以识别heat shock genes的启动子。Sigma 32过表达在大肠杆菌里面的时候，绝大部分形成了不溶的包涵体(inclusion body),我们的任务就是要用变性 剂溶解变性不溶的蛋白，然后做重折叠。 所有的buffer几乎都已经配好了，所以直接做就行了。我们先用1% Triton 来溶解细菌本身的一些蛋白，inclusion body 相当稳定，不溶于triton,所以这一步，绝大部分垃圾就被去掉了。 下一步就是用变性剂来溶解inclusion body。用什么好呢？Burgess教授提到了 sarkosyl。sarkosyl(N十二烷基肌氨酸钠）是一种比较强的阴离子去垢剂, 0.3%的浓度就可以让包涵体溶解。sarkosyl的优点是，虽然在高浓度下有变性作用，低浓度下却对蛋白质有稳定的作用。所以用sarkosyl做重折叠之前的变性剂是再好也不过的了。 Burgess还要我们试了经典的 Gudn HCl（盐酸胍)来变性，作为对比。inclusion body 在这两种变性剂下很容易就溶解了。然后我们得去掉变性剂，做重折叠。怎么做呢？方法有很多种，最简单的是透析，把变性剂全部换掉。这个方法Burgess并不喜欢，因为，透析是个缓慢的过程。在透析袋里面，蛋白的浓度还是很高。折叠中间产物容易相互接触形成不溶的聚合物。另一种方法是突然稀释变性的蛋白，由于蛋白浓度相对与透析低了很多，好一点。但是问题也是类似的。Burgess提议用逐步滴加稀释的办法。就是放一大烧杯的缓冲液，里面有一个磁石可以不断混合液体，然后一滴一滴加入变性的蛋白溶液。由于烧杯里的溶液蛋白量是逐渐增加的，所以一开始蛋白折叠中间产物能够相互作用的几率大大降低了。Burgess说的还真象那么回事，可事实上，嘿嘿。我们先用试着重折叠Gudn HCl溶解的Sigma32。一开始还好，滴到后来，溶液就变浑浊了，最后几乎成了冲淡了的牛奶那样的东东。Burgess脸色不好看，说不应该这样的。我们一离心，沉淀出来一大堆不溶解的蛋白。剩下的上清跑了一个Poros HQ 50阴离子交换柱，拿到的蛋白很少，回收率小于5%。失败啊。 从这里开始，我要岔开一下，讲一些跟这个模块实验没太大关系，但是很有意思的东西。 （四）Hydrostatic pressure和跑小柱子的trick Dr. Burgess 假定我们对蛋白质纯化一无所知，所以讲得很细致。比如他特别提到了disposable column的用法。这种小柱子很简单，把beads倒进去，冲洗一下就可以用来纯化蛋白了，很方便。唯一的问题是，由于是依靠重力跑，速度有时候会十分慢。液体流经柱子速度由hydrostatic pressure(静流体压力）来决定。而hydrostatic pressure又是由实际柱高(即液体经过的长度)来决定。如果你嫌液体流得太慢（尤其是洗柱子的时候），可以在柱子下端出口连一个长的塑胶管子或者针管，这样速 度会快很多。这是很简单的小trick, 但我觉得对初做蛋白质纯化的人还是很有帮助的。 我知道一个例子。我原来很喜欢女生A, 有一天晚上主动等在她实验室等她做完实验，就开车送她回家。这一等不得了，从晚上七点等到了凌晨一点。这个过程中，她好像没什么事情，但是每隔20分钟，她就会去一次cold room。作完实验了之后，我好奇的问她，到底是什么试验花了这么长时间，结果她说她在用一个disposable column纯化蛋白，由于beads 稍微多了一点，速度很慢，而protocol有一步要求用数百毫升的洗液来冲洗柱子。所以她每隔二十分钟就去加洗液，所以白白花了好几个小时。我听了之后都要ft了,没想到她们实验室竟然没有人告诉她, 有简单的办法可以让柱子跑得快一点的。只要在下端出口加一个长管子，她至少可以少等两个小时。 当然最简单的办法还不是这个，最简单的办法的是把盛有洗液的容器放高，然后利用虹吸的原理让液体源源不断的流经柱子。同时，柱子的下端连上塑胶管，弯成一个连通器，这个连通器的高度应该略高于柱面，这样冲洗结束后，柱子就不会干。如果用这种方法，A就不用在实验室待一晚上了，因为一切都是自动完成的。 我现在跟A已经完全没有来往了, 但我对她映象还是十分深刻，主要就是因为她那晚跑柱子的经历。话撤远了，现在再回到蛋百质纯化课。 （五）"万金油"buffer Dr. Burgess 这人特有意思，喜欢吹嘘他发现的小trick。比如，他得意说他是全美国最早用coomassie blue染蛋白胶的人。据他说，六几年的时候他看到一个澳洲的老兄的一片文章,讲述一种新奇的染料叫考马市亮蓝, 比当时流行的染料amido black灵敏十倍以上。所以他就写了一封信要了一些，结果效果奇好。我们听得都目瞪口呆。 不过Burgess最自豪的，还是他的“万金油”buffer。他告诉我们说，他几十年了，总喜欢用这个buffer的配方，什么蛋白都喜欢这种buffer, 可以说到了包治百病的神奇地步。尽管他吹得神乎其神，配方却十分简单。这个buffer叫TGE,就是Tris, glycerol 和 EDTA。配方是这样的: 50mM Tris pH 7.9 0.5mM EDTA 50mM NaCl 5% glycerol Tris EDTA NaCl 这三样都没什么，真正关键的是5%glycerol。有了这个glycerol, 很多蛋白，尤其是酶会十分稳定。这个稳定的效果是十分惊人的。Dr.Burgess就此跟我们讲了他的经历。六十年代的时候，他还是个小博士后，在watson 实验室里干，主要是纯化细菌RNA polymerase的各个亚基。那时候一个大问题是RNA polymerase纯化出来后十分不稳定, 放冰上, 过30分钟，活性还会损失一半。Burgess有一次不小心出了错误，把纯化出来的RNA polymerase和glycerol 混合了。结果意外发现，RNA polymerase 变得十分十分的稳定。稳定到什么程度呢,就是你把这个酶加上50%glycerol，用平信从美国寄十几天到澳洲，活性还有7~80%！另外Burgess也提到，如果要保存的蛋白有二硫键，加一点DTT，防止蛋白形成非天然的二硫键, 也会对蛋白质的稳定有好处。 为了让我们对这个 "万金油"buffer的好处有感性认识, Burgess设计了一个实验让我们做。他之前已经准备好了在大肠杆菌中表达的GFP包涵体(inclusion body)。我们把包涵体分成两部分，一部分用guanidinium hydrochloride（盐酸胍）溶解变性，另一部分用sarkosyl (N十二烷基肌氨酸钠）溶解变性。然后把这些溶解的GFP溶液分到一个96孔板上,每个孔10微升，然后加入２０倍的refolding buffer 来稀释，稀释了之后，变性的GFP就开始重折叠。我们有一个hampton 卖的refolding 试剂盒，内有十几种不同配方的refolding solution。我们试了所有这些buffer 同时还试了TGE, TGE+15% glycerol, TGE+35% glycerol, TGE+45% glycerol,这四种buffer。由于GFP折叠好了才能发荧光，用一个fluorescence plater reader，我们可以实时监控折叠的效果。结果让人很吃惊，Hamton卖的这个试剂盒，虽然配方都很fancy,但是一塌糊涂，没有一种溶液能让GFP重折叠的很好。相比之下，TGE的四种溶液都很好，GFP重折叠的效率是hampton kit的几十倍。最强的是TGE+35% glycerol。 另外，不论是用Gudn HC变性还是用sarkosyl来变性，TGE+glycerol 的重折叠的效果都很好。实验结果出来后，看着我们惊讶的表情，Burgess脸上都笑开花了，呵呵。这个实验我还学到的一个教训是,不能迷信商业化的kit, 很多kit吹得很牛，但并不一定真的好用。 （六）兴风作浪的乳糖(lactose) 晚上每天都有人做报告，我觉得让我收获最大的是Bill Studier的报告。本来这个报告是后来才听到的，但是由于Burgess的模块是唯一的涉及大肠杆菌钟表达蛋白的，我把这一段提前来说说。Studier这老哥是Brookhaven National Laboratory的，一生研究T7 噬菌体，也是T7 RNA polymerase induction system(pET 系列质粒)的发明者。 T7 系统在大肠杆菌表达蛋白的应用实在太广泛了，但凡表达蛋白的兄弟姐妹们的不可能不知道这个系统。长话短说，pET系列的质粒都用T7 promoter来控制基因的表达。T7 promoter只能被T7 RNA polymerase 识别，而这个咚咚大肠杆菌是没有的。但是有一些溶原菌株,染色体里面已经整合入了由LacUV promoter和lac operon控制的T7 RNA polymerase 基因片断。如果在细菌培养基里面加入IPTG, 来诱导T7 RNA polymerase 的表达，就可以启动目的蛋白的表达。这个系统非常强大，原因 在于T7 RNA polymerase工作起来非常有效率，效率高到什么地步呢？就是表达一个蛋白，表达量可以占到大肠杆菌总蛋白量的50%! 大家可以想象，这种系统虽然很强大，但是表达量太大，对大肠杆菌有毒性，造成的结果就是大肠杆菌十分排斥表达蛋白的质粒。 这一点我深有体会。我曾经想用细菌表达一个蛋白,而且估计这个蛋白会形成包涵体。妖怪的是，用质粒转化蛋白表达菌株BL21(DE3)怎么也不能转化，铺的板一个菌落也没有。我当时就怀疑是因为表达的蛋白对大肠杆菌有毒性，仅仅是本底的一点表达就足以杀死细菌。我来来回回一共转化了五六次，最后终于找到了唯一的一个菌落。虽然当时我怀疑过本底表达是罪魁祸首，但是我没有仔细想过本底是怎么 来的。 这个问题到了bill studier做报告之后，才真相大白。原来我们一般用的LB broth有三种成分，其中一种是tryptone. Tryptone是caseine的酶解产物，而casein又是milk里提取而来。由于milk 有乳糖(lactose)，tryptone里面也有乳糖的污染。Bill studier研究发现即使很微量的lactose也能有效的诱导蛋白表达。原来如此！！！ 所以要解决我原来的那个问题，用一种不含有乳糖的media做培养板就完事了。有意思的是，细菌有一种很有意思的特点，如果培养基里有足量的glucose，细菌会优先摄取glucose,而不能摄取lactose。Bill studier根据这个特点研究出一种可以自动诱导的培养基。这种培养基含有成比例的glucose 和 lactose。细菌首先摄取glucose，不摄取lactose,当细菌长到一定密度，耗完glucose之后，就开始摄取lactose,从而开始诱导表达。所以用这种培养基养菌，很省事，接种了第二天收细菌，提蛋白就行了。 最后Bill studier老爷子特别强调的是细菌的供氧。氧气是限制细菌生长最重要的瓶颈, 如果有足够氧气在培养基里面, 大肠杆菌的密度可以从一般的OD600 2~3 翻十倍到20~30!要提高培养瓶的供氧，可以用baffled flask。这种flask的瓶底边缘有几处凹陷(类似于可乐塑料瓶底那样的形状)，能有效增加空气培养基的混合。 最后，详细内容可以见下列文献: Protein Expression and purification 41: 207-234 (2005) [ Last edited by archaeosun on 2009-5-31 at 23:42 ] |
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92楼2018-06-04 16:24:12
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（七）古怪的CDC6 这里再给大家讲一个在大肠杆菌中表达蛋白质的例子，一个很夸张的例子，但是很有启发性。 Bruce Stillman 是冷泉港的现任主管，是一个绝对的牛人。不但科学做得很好，而且还很爱国。他是澳洲人，在美国待了N年，却从没有加入美国国籍，所以他只是外籍院士。我们的晚间报告有一个是他作的。他主要研究真核生物的DNA复制。这是一个到现在为止都没有完全弄明白的领域。在报告里面，他特别提到了表达纯化CDC6蛋白的经历，我觉得十分有意思。这个蛋白, 用他的话说，是"a pain in the ass"。 CDC6是干什么的呢？这要从ORC说起。真核生物的DNA有多个复制起始位点 (replication origin)，ORC(Origin Replication Complex)是一个很大的蛋白复合体，可以识别这些复制起始位点。ORC在整个细胞周期里面都是与DNA结合的。在G1期里面，CDC6这个蛋白会与ORC结合，同时让MCM(DNA解旋酶)也装载到ORC上,形成一个prereplication protein complex。这个complex一旦形成，DNA 复制的准备工作就完成，只等其他kinase的激活，细胞从G1进入S期，复制就开始。 Stillman 实验室一直想表达酵母的CDC6和ORC的重组蛋白，然后做结构研究。但是到了CDC6，他们碰到了大麻烦。首先他们尝试真核系统来表达，但是意外的是，他们发现表达出来的CDC6完全没有活性。然后他们尝试用大肠杆菌来表达。首先发现37度诱导表达出来的蛋白不溶，重折叠也没有用。然后他们尝试在室温下诱导表达，发现蛋白虽然可溶了，但是都被降解了。然后呢，他们就想到了加一个GST tag,这下好了，蛋白也可溶了，也不被降解了，但是还是没有活性。他们估计是因为GST可以形成dimer，干扰CDC6的正常功能。所以呢，他们重新做了一个construct,在GST和CDC6序列中间加了一个蛋白酶切割位点。正当他们满心欢喜的以为问题解决了的时候，意外又出现了。有GST的CDC6是可溶的，可是一旦把GST切掉了，CDC就沉淀出来了....@#%#^&%$^#!!! 几乎是山穷水尽了，但是做这个project的博士后还是没有放弃希望，他做了最后的孤注一掷。他猜到这个蛋白可能很不稳定，对缓冲液要求可能很高，所以他让一个本科生连续试了十多种buffer，最后发现如果用磷酸钾＋谷氨酸钾缓冲液，切掉GST之后CDC6就不会沉淀了。Stillman认为谷氨酸根和磷酸根跟氯离子相比更接近与核酸, 可能让CDC6更稳定。这个CDC6一共花了他们18个月时间, 却就这一点小trick! 这以后，他们表达的CDC6都有活性了，后来做了一系列的电镜三维结构重构实验，研究CDC6和ORC的复合体结构。Stillman实验室正在准备一篇文章要投到nature上去。大家等着看把。 （八）”液体DEAE“ 绕了这么大一圈，现在再回到第一个模块的实验来。前面提到Dr.Burgess要我们 试Gudn HCl溶解sigma32之后的重折叠，结果很糟糕。我们接着试了用sarkosyl做 变性剂的蛋白重折叠。步骤和前一个类似，只是这一次是突然稀释至25倍体积。效果好了很多，至少没有浑浊现象了。接着我们用Poros HS 50，一种阳离子交换柱，来把可溶的sigma 分离了出来。为什么这一次用Poros HS 50 而不是前面用的阴离 子交换柱呢？因为sarkosyl带负电，会与阴离子交换柱结合得很好。再加上sigma32 很奇怪，既有负电的表面，又有带正电的表面，所以可以用阳离子交换柱。值得一提的是绝大部分蛋白质都是偏酸性，所以阴离子交换柱用的比阳离子交换柱频繁得多。 好了，聊完离子交换柱，现在回到Dr Burgess要我们作的另一个很重要的实验。 Sigma32在大肠杆菌过表达的时候，绝大部分都是inclusion body,但是也有一部分 是可溶的。这些可溶的sigma 32可以和细菌体内的Core RNA polymerase结合形 成复合体。我们这个实验就是要把这个复合体纯化出来。核心办法是用免疫亲合柱来纯化。但是为了提高纯化的效果，Burgess要我们提前用PEI沉淀的办法来粗分一下。PEI 是什么呢？就是polyethyleneimine （聚乙烯亚胺）。这个东东我过去没碰到，所以很感兴趣。PEI呢是一个带正电的polymer，和酸性蛋白质和核酸结合以后聚合体沉淀出来。由于这种结合是受离子强度影响的，感觉上很象DEAE那之类的性质，所以Burgess称之为"液体DEAE"。RNA polymerase和DNA是结合的，所以PEI沉淀DNA的同时，把RNA polymerase+sigma32都沉淀了下来。然后再用高盐洗脱蛋白质，而DNA和PEI结合很紧密，所以还是在沉淀里面。这样一来，好多垃圾蛋白和核酸都被去掉了。到了这一步，还有一个问题。就是洗脱下来的蛋白里面还有PEI,如果现在就用透析的办法降低盐浓度，PEI和蛋白会重新形成沉淀。所以下一步就是用硫酸胺沉淀的办法把蛋白和PEI分开。用低盐buffer重溶沉淀的蛋白,过免疫亲合柱就行了。免疫亲合柱就没有什么好说的了。最后结果很不错，跑胶后用coomassie blue 就可以清楚的看到RNA polymerase的各个亚基。 （九） 沉淀，沉淀，沉淀 上一部分我匆匆提到了用硫酸氨沉淀来去掉PEI(Polyethyleneimine）的步骤。不常做生化的同学可能对硫酸氨沉淀的方法不熟悉。但其实这种沉淀是蛋白质纯化中及其重要的一种方法。说实话我过去也很少接触，但是在这个课里面，四组实验中有 三个都用到了这个方法，可见其重要性。 硫酸氨沉淀是怎么做的呢？其实很简单，把磨细了的硫酸氨粉末往样品溶液里 倒就行了，蛋白就会相继沉淀下来。由于不同的蛋白，在不同的硫酸氨浓度下被分 别沉淀下来，这种方法把蛋白质样品粗粗的分离一下。这种方法对大量样品尤其好 用，因为比较方便快捷便宜。硫酸氨沉淀的优点是什么呢？最大的优点是这东西虽 然能让蛋白质沉淀下来，但是不会让蛋白质变性，所以沉淀下来的蛋白质一般可以 重新溶解。 其实沉淀蛋白质的方法有很多种，但是对于娇贵的蛋白质来说，很多常用方法 都太harsh了。我举两个例子把：TCA沉淀大家都熟悉的。TCA是个强酸，施放出 来的质子中和了蛋白质的负电荷，只留下正电荷与TCA形成不溶物，从而变性。 丙酮沉淀，通过改变介电常数来降低蛋白质的溶解度，从而沉淀，由于丙酮一类的 有机溶剂可以与蛋白质的疏水表面相互作用，所以沉淀的同时，蛋白质也会变性。 硫酸氨沉淀的机理是什么呢？简而言之就是盐析（salt out）。蛋白质在溶液里 面溶解度和盐浓度有关系。在低盐浓度下，如果增加盐浓度，会增强蛋白质的溶解，这是因为，盐的离子与蛋白质表面的正负电荷配对，减少了蛋白质电荷表面相互作用的机会。当盐浓度高到一定程度的时候，过多的盐会跟蛋白质疏水表面争夺水分子，以至于蛋白质疏水表面倾向于相互作用形成聚合物沉淀下来。 硫酸氨如果运用的好可以帮很大的忙。Dr. Burgess讲过一个例子。他有一年去 一个公司做sabbatical。这个公司是做单抗的，有一个工序是要从ascites fluids 里 头把抗体给纯化出来。这个公司用硫酸氨沉淀的方法来粗分蛋白。Burgess很惊讶的发现，这个公司竟然没有做仔细的分析，就随便用了一个很高的硫酸氨浓度，结果把抗体和serum albumin一起沉淀了。但是其实可以用一个低一点的浓度，只把serum albumin沉淀下来，从而把抗体和serum albumin分开。Serum albumin浓度是非常高的了，这样一分，大大提高了后续纯化步骤的效率。 Dr. Burgess强调说，用什么浓度把什么蛋白沉淀下来，完全是经验性的，而且每 次都不一定能重复的。因为是否能沉淀下来跟蛋白质浓度有关系，而每次样品内目标蛋白的浓度不一定一样。有一个很简单的方法可以用来估计蛋白质沉淀所需硫酸氨的浓度。把样品分成五份，每份分别加硫酸氨至20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 离心去掉沉淀，保留上清，再向上清里面添加硫酸氨使浓度从20%到30%, 30%到40%, 40%到50%, 50%到60%, 60%到70%，离心保留沉淀，然后分析沉淀里的蛋白, 看看目标蛋白到底在 哪里，就完事了。 （十） 永远的转录因子 第一个模块的实验结束以后，我们进入第二个模块的实验。这个实验的指导教授叫Al Courey。这个模块的实验主要是要从Hela细胞里纯化AP-1。AP1是一种很重要的sequence specific转录因子，在很多生理过程里都有作用。AP-1其实不是一种均一的蛋白质，实际上一种二聚体结构，要么 是Jun-Jun 或者是JunFos dimer。Jun和Fos都是alpha helix的结构。Helix的一边有很多Leu,和另一个helix形成Leucine Zipper的结构，而helix另一边就是碱性的氨基酸居多，所以可以和DNA 结合。这个转录因子看起来就象一双筷子夹着DNA。 sequence specific转录因子是极其重要的一类蛋白质，真核生物的基因有5~10%是用来编码这种蛋白的。这个模块涉及的一些实验是最经典的一些分离转录因子的方法，所以很有用。 怎么才能分离纯化呢？首先要确定要纯化什么因子，换句话说就是要决定纯化跟什么特异DNA序列相结合的转录因子。决定了这个，才能有一个活性检测系统，才能真正开始纯化。另外就是，可以把这种特异序列的DNA固定在柱子上，然后做亲合层析，纯化效率会非常高。 整个纯化过程是这样的：首先制备Hela细胞的核提取物，然后用硫酸氨沉淀的办法粗分一下组分，小分子量蛋白(比如Histone H1) 因为无法沉淀而被去掉。到这里比活力会增加到原来的2倍。然后粗分的产物再跑一下凝胶过滤层析，比活力再提高到初始产物的5到10倍。凝胶过滤的产物再过DNA affinity column, 比活力从5-10倍一下子提到了50~100倍。到了这一步，AP-1可以占到蛋白量的 10~50%。 值得一提的是这个凝胶过滤层析。我们用的是Sephacryl S-300 HR 凝胶(一种聚 丙烯酰胺凝胶)，这种凝胶分辨范围大概是10KDa到几千KDa，但是这种凝胶是比较粗的一种介质，分辨率不能跟superdex之类的比。大概由于不是那么精细，所以可以自己手工装柱，我们用的柱子是Amersham的XK26/40(直径2.6cm, 高度40cm）。装好的柱子分辨率真的是很低，AP1的洗脱体积跟空体积(void volume）相差挺小，而AP-1只有40~50KD已经很小了。这样一来很多蛋白根本没可能和AP-1分开！这也就是为什么这一步纯化倍数很小的原因。这样一来，为什么要自找麻 烦做这又贵又麻烦的一步呢？原因在于这一步可以去掉核提取物里面的核酸酶，所以如果直接跑DNA affinity column, column上的DNA Oligos会被降解掉！另外一个原因是，核提取物有一些可以和DNA非特异结合的蛋白，这些蛋白会饱和DNA affinity column，影响要转录因子的纯化。 这个纯化步骤说明，不同的纯化手段必须加以精心组合才会有最好的效果。 （十一）核抽提物 上回谈到纯化AP-1转录因子的大致流程。其实在过柱子之前的核抽提物的准备 也是十分关键的。从天然产物中纯化蛋白，如果大概知道蛋白在什么细胞器官，把 细胞器先分离出来作为纯化的起始原料，可以省好多事情。因为细胞器官的分离的 方法已经很成熟了。 核抽提物是怎么准备的呢？首先，融解Hela细胞。我们在这个模块用的细胞都不 是自己长的，而是直接从一个公司Biovest 买来的。据说这个公司有NIH的补贴， 所以价钱不贵。一升media的Hela细胞才要１７刀。冻存在-80度的hela泡在有 glycerol的buffer里面，第一件事情就是要用有镁离子的PBS来冲洗几遍。然后用 一种低渗buffer来重悬细胞。这种低渗buffer盐浓度很低，所以由于渗透压的影响， hela细胞膜会变得比较脆弱。这个时候呢，把重悬的细胞用Dounce 匀浆器处理一 下,把细胞膜弄破。低渗buffer里头虽然盐浓度很低，但也不是没有盐在里面。主要 有两种成分，一个是10mM KCl ,另一个是 1.5mM MgCl2。KCl没有什么好说的， 可以换成NaCl。MgCl2 就关键多了。镁离子可以稳定细胞核, 让细胞核不至于在破 碎细胞的时候就破裂。当然说是这么说，一些转录因子还是可能在匀浆的过程就漏出来。细胞膜破碎之后，细胞核还是基本完整的，细胞质里面ER , Golgi之类的东东都漏出来了。然后再来一个低速离心。细胞核是比较重的，所以一离心，马上就沉淀下来了。而其他细胞质或者细胞膜的成分比较轻一些，还留在上清里面。 现在想起来，细胞器官的分离，几乎无一例外都是利用细胞器比重不一样来分离 的。细胞核是最好分离的了，因为比其他的膜结构重得多。有些细胞器，比如要把Golgi和ER分开，是个十分麻烦的事情，因为比重相差太小了。有些时候，可以用一些古怪的办法来分离。比如lysosome把，比重和线粒体及过氧化酶体很相近。一种办法就是往一堆无辜的耗子注射一种特殊的去垢剂叫Triton WR1339。耗子根本不能分解吸收这种化合物，就积累在肝脏细胞的lysosome里面，使得lysosome比重变轻了一些，这样就可以把lysosome从mitonchondria和peroxysome分出来了。话扯远了，现在再回到AP-1purification。 细胞核虽然被沉淀下来了，但里面还有很多染色质,如果DNA都降解漏出来，麻烦就大了。所以下一步就是用高盐buffer(0.42M KCl)来破碎细胞核。核膜，染色质之类的垃圾不能溶解，转录因子之类的蛋白却能溶解。再一离心，取上清就行了。我们要的转炉因子就在这里面。按理说，到这一步就可以上柱子了，但是这种上清溶液里面还有不少histone H1，可以抑制体外转录反应。为了祛除hisone, 我们又做了一步硫酸氨沉淀，histone由于太小，沉淀不下来，而转录因子什么的都可以被沉淀下来。沉淀重悬一下就可以跑Sephacryl S-300 的柱子了。 （十二）Gel filtration的先天缺陷 上一篇讲到核提取物。实验的下一步就是跑Sephacryl S-300 column。 这一步实验是整个课程中第一次跑凝胶过滤色谱(gel filtration chromatography)， 我感觉还是很激动的。Gel filtration 是色谱中及其重要的一个种类。我先来谈谈 原理把。Gel filtration柱的材料是由高分子聚合物做的微珠。这些微珠呢，并不是 实心的，而是有很多孔状结构。当蛋白质样品经过这些微珠的时候，如果蛋白质分 子体积太大，不能通过微珠的孔状结构，就会绕过微珠，很快的被洗脱下来。如果 蛋白质分子体积不是那么大，可以通过微珠的孔状结构，就会迟一些被洗脱下来。 这样，蛋白质分子可以根据大小而被gel filtration column分开。 Gel filtration 和其他色谱方法一个显著的不同是：Gel filtration 并不依赖 蛋白质分子与柱材料的结合来分离蛋白。这个特点的一个好处是，所有的蛋白样品 最后都能被洗脱下来，柱子重复用也不会有什么问题。但是这个特点也给Gel filtration带来了一个严重的缺陷：低分辨率。分辨率包括两个因素，一个是两个蛋白峰的距离，另一个是，蛋白峰的宽度。由于蛋白在gel filtration column里面并不与柱材料相互结合，所以很容易扩散(diffusion)，扩散的结果就是蛋白峰非常宽。这个宽度非常要命，很多时候即使用了很好的柱子，蛋白顶峰也大致能分开, 但是由于蛋白峰太宽，重叠在一起，这样就很难分干净。另外，两个不同大小蛋白的洗脱体积的差别与分子量差别的对数呈线性关系，所以可以想见，如果分子量相近（比如只差两三倍）的话，洗脱位置也会相近，Gel filtration是很难把两个蛋白完全分开的。 说一件我的糗事。有一次一个师妹遇到了一个难题，表达一个GST-tagged的蛋白 有一个降解产物。她想要的蛋白50kD,而那个降解的产物有30KD。她问我该怎么分开。我没仔细想，就告诉她用Gel filtration。现在想起来，这实在是个昏招。当然，欣慰的是，该师妹最终没有试gel filtration, 用别的方法解决了这个问题。:-) 如果要想蛋白峰宽度变窄一点，怎么办呢？就样品而言，体积越小越好，理想状况是小于柱体积的２％。就柱子的材料而言，最主要的就是得把微珠做小一些，这样空体积就会小一些，扩散就不会那么严重。另外柱子里的微珠大小均匀一些也会有帮助。这种改进带来的一个问题就是，需要用FPLC之类的设备提供较高的压力, 柱子才跑得动。另外分辨率好的柱子往往不能手工装，得买预装的柱子，这样就很贵（很贵很贵！！！）。 唠叨了一大堆，我想表达的一个中心意思就是：如果你想从一个蛋白质混合物很干 净的把一个蛋白纯化出来，Gel filtration是肯定没戏的。虽然gel filtration 不能很精细的纯化蛋白，但是它还有另两个非常重要的用途。一个是脱盐，另一个是确定蛋白大小。这两个用途是其他种类的色谱没法作到的。 |
2楼2009-05-31 01:33:04
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（十三）装柱子的学问。 上篇提到了Gel filtration的基本原理，现在谈谈我装柱子的过程。我们用的是Amersham 的 XK26/40的空柱子，然后往里面填充Sephacryl S-300 HR 的resin。按道理说，要提高分辨率，柱子应该是越长越细才好，这种柱子虽然不短，但是挺粗的。但是一个好处就是，样品体积可以大一些。 装柱子本身就是一件很tricky的事情，以至与这课的教程上专门列了一小节来解释怎么装柱子。我们这一组人中，我负责装柱子。一开始就是洗resin了，用粗制烧结玻板过滤的漏斗来洗，感觉这方法还挺快的。洗完了，就把resin重悬成50%的slurry，然后就是往柱子里头倒了。但是呢，有一个小窍门，就是必须先封闭柱子的下出口，往柱子里面倒10%体积的buffer。我过去装柱子犯傻，不知道要这么做，结果发现下面的resin 不均匀不说，还有一大堆气泡。所以先加buffer是很必要的。倒slurry的时候还得用玻棒引流，这样可以尽可能的避免气泡。然后就是等了，等resin 沉降３０分钟后，就可以打开柱子的下出液口，让多余的缓冲液流出去。液面低到靠近柱面的时候呢，就可以把上端液流接头接到柱子上方。这个过程最麻烦了，主要是不能引入气泡，所以先得让这个接头装置里面充满缓冲夜，把气泡赶出来。我第一次做没经验，费了九牛二虎之力才搞定了。然后就是接上蠕动泵(peristaltic pump) 加压，让resin继续紧缩一下。随着柱面的下降，接头装置还得不断往下移动，使得接头刚刚好与柱面接触。接触不紧密的话，等于是冲淡了样品，分辨率会降低。 柱子装好了，但还不能开始跑样品。为什么呢？因为这种柱子的质量必须很好才能起到分离蛋白的效果，否则是根本没法work的。所以呢，首先得测试这个柱子是否真的装好了。测试过程很简单，就是跑一下蓝色葡聚糖(blue dextran)，蓝色葡聚糖是带有蓝色染料的多糖高分子聚合体，体积非常大，所以在空体积(void volume)就会洗脱出来。跑蓝色葡聚糖可以起到三个目的。第一个就是确定void volume，知道这个空体积是很重要的。因为每次装柱子，实际resin的总体积都会有微小的不同。特定蛋白在柱子的洗脱体积与空体积的比值是一定的，所以只要知道了空体积，就能知道蛋白大概会在什么时候洗脱出来。第二个就是确定样品会被稀释多少。第三个呢，是柱子是否装的均匀。如果装的不均匀，葡聚糖j就会跑得形状怪异。一般来说呢，柱子下端堆积会比上端均匀，为了分辨度好，应该从更均匀的一端上样。所以我们在做的时候，是从下端上样的。 忙活了半天，当所有装置都装好的时候，感觉还是挺兴奋的。首先是蠕动泵，然后是柱子，然后是UV monitor加记录仪。整套装置不贵，功能却很齐全。 （十四）anfinsen的疑虑 跑完sephacryl柱子，组分就可以过DNA affinity column。DNA affinity column虽然很重要，但是这一步技术上来说要求很低。买来CNBR活化好的agarose，然后让特定序列的寡聚核苷酸固定上去就行了，柱子也是最简单便宜的一次性柱子。 亲合层析是目前最常用也最强大的一种蛋白质纯化技术, 纯化效率比别的层析方法可以高出一两个数量级。这种方法诞生是六十年代的事情。当时是在NIH的Anfinsen实验室。Anfinsen是一个诺贝尔奖获得者，可以说是蛋白质折叠研究的老祖宗。他主要贡献是通过研究ribonuclease 的变性和重折叠证明氨基酸序列就可以决定蛋白质最后的三维结构。他实验室那时侯有一个学生一个project是从葡萄球菌里面提取大量核酸酶，然后研究enzyme/inhibitor interaction。这个纯化可是很麻烦的事情，用gel filtration, ionexchange, hydrophobic interaction, 效率都很低。有人可能会问，怎么不在E.Coli表达his-tag重组蛋白，然后用 Ni- beads纯化啊？答案很简单，那个时候根本没有molecular cloning 这些技术，也没Nibeads这些东西，Nibeads也是亲合层析的一种，是好多年以后才发明的。这个学生有一天突发奇想，既然inhibitor可以与enzyme结合，为什么不能把inhibitor 固定在beads上面，然后用来纯化蛋白呢？后来他试了一把，结果非常成功。搞笑的是，anfinsen自己很怀疑这个技术是否能work, 勉强答应把自己名字署在在那个学生的文章，还强调如果没有别人能重复，自己心就是悬着的。呵呵。从此以后，各种各样的亲合层析层出不穷，成为生物实验室蛋白质纯化的最主要工具。 八卦完历史，现在介绍一下亲合层析的种类。通用的亲合层析包括IMAC(Immobilized Metal Affinity Chromatography)和IAC(Immunological Affinity Chromatography)。这些东东 大家应该都熟，类似于Ni beads , proteinA beads 之类的东西， 几乎所有人都会用到。需要动点脑筋的是一些利用特定蛋白质特定性质的亲合层析。比如我们实验室研究的糖基转移酶把，有两个反应底物，一个是nucleotide-sugar,另一个是一个小蛋白质 EGF repeats。 由于这个酶与两个底物都有结合， 所以可以把这两种底物分别结合在beads上，然后跑两次亲合层析。AP-1的纯化呢，则是利用了转录因子与DNA序列的特异结合。所以呢，在做亲合层析之前，一定要根据蛋白质本身的特点来选择相应的ligand。决定了ligand之后呢，就得考虑怎么把ligand偶连在beads上了。 CNBr活化是最常用的一个方法。原理很简单，CNBr的碳对beads上的羟基发起亲电进攻，产生一种叫cyclic imido carbonate的中间产物, 蛋白质或者核酸的伯胺基团(primary amine , -NH2) 与其发生反应， 形成共价键联在beads上。 蛋白质的primary amine主要来自于lysine, 如果要偶连的蛋白没有lysine用这种偶连方法就不好。DNA的primary amine来自于AGC三种碱基。DNA是双链互补的结构，碱基上的primary amine都要形成氢键。所以呢，要想把DNA oligo固定好，必须 得有不配对的overhang才行。这是一个小窍门，但是给我们的一个启示是，要做好affinity resin, 了解一些基本的偶连方法的化学原理是很有用的。 （十五）AP1的活性测定 第二个模块的实验，DNA affinity chromatography之后我们又跑了一个更精细的 Gel filtration，用的是Amersham卖的Superose 6预装柱子。纯化步骤就只有这么多了。剩下的就是一些活性测定。无论是sephacryl分出来的组分还是DNA affinity column分出来的组分，我们都测试了AP1的活性。方法呢就只有两种，一种是凝胶迁移率变动分析(EMSA)，另一种是DNA水解酶I 足迹分析 (DNase I footprinting assay)，都可以用来分析蛋白与特定DNA的结合能力。我过去没做过这两种实验，所以感觉很新奇，做的也格外卖 力，结果也还不错。 Gel Mobility-shift assay 原理很简单，把蛋白质样品和P32标记的寡聚核苷酸探针 一起孵育十几分钟, 然后拿去跑一个低浓度acrylamide胶。如果探针结合上蛋白了，速度会变慢很多，就会停滞在胶的上段；如果没有结合上，探针就会自由的跑到胶的下段去。然后把胶拿去做放射自显影就行了。跑胶的装置块头挺大的，是用来跑DNA测序胶的装置。把两大块玻璃板和两片spacer夹起来之后, instructor先做一个gel plug，就是配少量gel溶液，然后加过量的TEMED，然后迅速加到玻璃板中间，这些胶还没漏完就会凝固，所以会封住底端。这是一个小窍门，据instructor 讲，这个方法虽然很粗糙，但是比其他任何封底的办法都管用。还有一个小窍门。是这样的，由于胶的浓度低，比较脆弱，另外尺寸比较大。跑完如果把一块玻璃板从胶上拿开的话，胶的某些部分会分别粘在两个玻璃板上，这样取胶的时候就很容易把整个胶弄破。我们做胶的时候，指导老师要我们把一块玻璃板的贴着胶的一面硅化（用sigmacote, 成分是氯化有机硅氧烷) 一下，使得这一面比较疏水，就不会与胶粘在一起了。这样打开胶夹层的时候,胶只会紧紧贴在一面玻璃上面，把胶和这整块玻璃拿去放射自显影就行了。生物实验要想令人心服口服，没有对照是不行的。EMSA也不例外。阳性对照很简单，是看看系统能不能work。关键是阴性对照，来看蛋白质与探针的结合是否特异。EMSA的阴性对照有两种，一种呢，是用来看和探针的结合的蛋白是不是特异的某一种蛋白。做法很简单，就是蛋白质和探针孵育的同时加入抗那种蛋白的抗体，抗体识别蛋白质之后会形成更大的protein complex,在胶看起来就是探针的迁移率进一步降低了。这叫"supershift"。另一种对照呢，是看蛋白质与探针的结合是不是与探针序列有关，因为如果是非特异性的结合，纯化就没有意义了。这种对照也很简单，在蛋白质与探针孵育的同时，加入没有同位素标记的探针来竞争。如果加入完全同序列的竞争DNA可以削弱protein-DNA interaction， 一两个nucleotide不一样就无法削弱的话， 说明看到的探针与蛋白质的结合是跟探针序列紧密相关的。 我们在实验中用了 第二种control, 效果挺惊人，仅仅是两个nucleotide和探针不一样，竞争DNA探针就没 法work了。 Gel Mobility-shift assay虽然能够证明一段Oligos是否能和蛋白质结合，却还是不 能告诉我们该蛋白质到底与哪一小段的序列直接接触。DNAase I footprinting assay 正是用来解决这个问题的。DNase I 可以随机的分解DNA，正常情况下，一段DNA探针各处被酶切的可能性大致相当，如果跑胶再做放射自显影的话，看到的会是DNA ladder一样的东西。但是，如果有蛋白与特定区域相结合，DNase I无法酶切那一部分，我们看到的ladder 就会空缺一部分。这样我们可以知道那一部分没有被切到。这个实验步骤其实不复杂，但是有些tricky，实验的关键是DNase I 的用量和酶切时间。首先是做同位素标记探针的stock solution。stock solution里面除了探针以外，还加了非特异DNA,类似于poly(dI-dC) poly(dA-dT)之类的东西。有一种成分引起了我的注意，聚乙烯醇(poly-vinyl alcohol)。 这东东比较粘稠，为什么要加它呢？大家想想看，用来做DNAase I footprinting assay 的样品都是通过跑柱子的fractions，转录因子必定是被稀释得很厉害的。足迹实验最关键的就是要保证样品蛋白和探针有充分的结合。聚乙烯醇性质就象一个"分子海绵"，占溶液体积不说，还跟蛋白质抢夺水分子，所以加入这个东东之后呢，蛋白质和探针的有效浓度都增大了，这样有利于蛋白质和探针的相互结合。聚乙烯醇的作用原理跟PEG很相似，第三个模块的实验里面会用到PEG沉淀。探针stock solution配好之后，就是加我们纯化出来的组分，孵育十几分钟。之后呢就是做DNAse I 酶切。我们这一组里，我和丹麦女生负责做酶切，这个酶切可是把我们忙坏了。为什么呢？酶切一共有三步，间隔时间很短。第一步是加Ca2+和Mg2+孵育一分钟, 第二步是加DNase I 孵育一分钟, 第三步是加反应中止液。我们是三个三个一做, 每20秒加一个样品, 这样三分钟三个样品都完成了。丹麦女孩计时，然后我加样品。可能是太紧张了把，我们连犯了两次错误，漏加了Ca/Mg，只得重做几个样品。最后看结果的时候，我还特紧张，因为这是很重要的一份试验数据，最后结果很不 错，还受了老师表扬，呵呵。 好了，第二模块的实验，到这里就差不多了。这个培训课两星期的课程也进行了一 半。全体成员放假一天休息，而放假前一天晚上也没有报告。我学校离CSH很近，索性晚上就溜回去了，顺便还把YL硬拉出来听我汇报学习心得，呵呵。 （十六）浮起来的细胞膜 休息了一整天，晚上全体学员和老师去一家sushi店饱餐了一顿生鱼片。第二天 早上，第三个模块的实验开始了。老师是Sue-Hwa Lin， 这一个模块是从大鼠肝脏里面提取胰岛素受体并且做一些鉴定。四个模块的实验之中，我最喜欢这个模块。主要是因为这是唯一一个设计膜蛋白纯化的实验，而膜蛋白纯化是所有蛋白质纯化中最麻烦的一类。受体蛋白纯化尤其麻烦，往往可能找不到又快又准确的测活办法。胰岛素受体即使溶解在去垢剂里面也能与胰岛素接合，所以用简单的binding assay就可以测活了。相比之下有些受体就不那么好伺侯了，比如我研究的Notch受体，配体也是膜蛋白，Notch和配体必须都簇集在细胞表面或者固体表面才能有接合，溶液中的游离状态下根本没法相互作用。 Sue-Hwa Lin是一个好老师，喜欢在做实验之前详细给我们讲解背景知识，这一 点上她比其他三位老师都做得好。另外她的助手是一位台湾的中年妇女，在Sue-Hwa 实验室做research assistant professor。这位助手特别nice，给我帮助很大。 好了，现在聊一聊纯化的实验步骤。首先是把大鼠肝脏的质膜部分分离出来，然 后呢用去垢剂溶解一下，用凝集素层析来粗分一下组分，然后做受体测活与鉴定。大家可能注意到，最后纯化出来的受体只是粗产品。事实上，手册上这个实验里面还得做一步insulin affinity chromatography来精制一下的。但是最近好多年，很多学员更希望做一些重组蛋白纯化的实验，所以就把原来的实验给切短了。我觉得这种做法很不明智，因为重组蛋白纯化的实验实在不需要花几千刀来冷泉港学的。 细胞膜结构的分离是一门大学问，著名的Methods in Enzymology有专门的一辑 整本都是讲这个的。细胞膜结构主要有核膜，质膜，线粒体，内质网，高尔基体，溶酶体等等。其中核膜是最容易的，因为细胞核很重，稍微离心一下，就沉淀下来了。其它的膜结构中呢，线粒体是最重的，质膜由于有胆固醇成分，所以是最轻的。这两种膜结构也是很好分开的。剩下的膜结构比重比较相似，所以不好分。 膜结构分离的方法呢，有很多种，但是变来变去，无非都是两种基本方法的组合： 差速离心+蔗糖梯度离心。差速离心（differential centrifugation）是粗分膜结构的 一种常用方法。其实很简单，就是用不同的速度离心三次。首先用等渗缓冲夜来做组织的匀浆，然后就开始离心。第一次是低速离心，只用600g，这么小的离心力下，只有未破的细胞和细胞核才会沉淀下来。细胞主要的膜结构以及细胞质都还在上清里面。拿上清再做第二次离心，这回离心力大了一个数量级，到了8000g。由于线粒体比其它膜结构要重一些，所以线粒体沉淀下来，而其它膜结构还在上清里面。去上清进行第三次离心，这回离心力比前一次又要大一个数量级到了十万g。所有的膜结构都会在此时沉淀下来，所以也包括质膜。需要强调的是，差速离心的分离是非常粗糙的，并不是十分干净。下一步的蔗糖梯度离心就要精细得多。但不管是什么分离方法，本质上都不完美，千万不要指望从某篇文章找到一个方法就能套用。最好的办法是利用细胞膜结构特征性的一些标记物（比如plasma membrane, 测5' nucleotidase 的活性)来分析分离方法的好坏，并加以改进。 我们分离质膜用的方法稍微特殊一点，省掉了差速离心这一步。这种方法对于分离 大鼠肝脏质膜比较管用，对别的组织就不一定好用了。我们一组四个人，每人都分了一个新鲜冰冻的大鼠肝脏（解冻后很难闻），然后就是拿刀片剁啊剁。弄碎了之后就加一种低渗缓冲液，再把碎的肝脏和缓冲液倒到Dounce匀浆器里面做匀浆。匀浆用的缓冲液里面加有Ca2+，比较重要。钙离子能够促进质膜碎片的聚集，这样在1500g这样小的离心力下，质膜也能被沉淀下来。我们把匀浆用两层cheese cloth过滤，去掉了很多结缔组织。然后就是用1500g离心了。拿出离心管一看，果然有一个很松的pellet，包括了质膜，细胞核之类的东西。然后再把pellet转移到Dounce匀浆器再弄均匀了。下面就开始准备蔗糖梯度离心(sucrose gradient)。蔗糖梯度离心是十分古老的一种方法，但直到现在还有很广泛的应用。我们首先往pellet 匀浆里面加69%的蔗糖溶液，一直到终浓度变为44%为止。蔗糖的浓度十分的重要，如果不准的话，根本就没法分开。我们有一个折射仪，可以很快的测出溶液的折射率以及对应的蔗糖浓度。这个折射仪看起来很粗糙，但是却十分好用。下一步呢，就是把加了蔗糖的匀浆转移到超速离心管里，然后在上层铺一层42.3%的蔗糖溶液，接着就是超速离心两小时（九万g）。前面提到过，质膜相比其他膜结构而言是比较轻的，所以呢，在离心的过程中就会浮到上层来。我们吃罢午饭，就回来看离心管，果然看到一层棕色的东西浮在最上面。这层质膜看起来有点像果冻，可以用小勺舀出来。到这里质膜的分离就算完成了。 |
3楼2009-05-31 01:38:07
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（十七）何去何从 上一章提到从大鼠肝脏提取质膜的方法。质膜准备好了，下一步就得考虑怎么溶解质膜。最主要的问题是：用什么去垢剂呢？Dr.Lin在这一步试验里面要求每一组中的四个人各选一种去垢剂来溶解质膜，纯化完之后再比较不同去垢剂的蛋白质纯化效率，看看哪一种去垢剂最有效。选择去垢剂很简单，无非是想让膜蛋白能被充分的溶解解离下来，同时又不使蛋白变性。事实上，纯化膜蛋白时去垢剂的选择是没有规律可循，除了一些显而易见的不适和做纯化的去垢剂(比如SDS)外，很难讲什么去垢剂好什么去垢剂不好。所以，只能具体问题具体分析，一个一个去尝试。我们这一组人选的四种去垢剂分别是: Triton X100, Sodium Cholate, Chaps, 和Octyl glucoside。我选的是Octyl Glucoside。 好了，我先来讲讲去垢剂的小常识。去垢剂其实是很大一门学问，我几年前就花过好多力气来学习其中的一些知识，但到现在为止还是只懂了一些皮毛。这里就权当抛砖引玉了。首先，什么是去垢剂(detergent)呢？就是同时具有疏水和亲水两种基团的化合物。虽然脂类化合物也有类似性质，但是去垢剂能够形成胶束(micelle)，所以相比之下非常易于在水中溶解。去垢剂的疏水基团一般是下面三种(1)直链或者支链烷基结构(2)类固醇之类的多元环结构(3)取代苯基结构(比如大家常用的Triton X100或者NP40)。去垢剂的亲水基团一般有(1)羧酸基团，比如胆酸钠(sodium cholate) (2)两性离子基团, 比如CHAPS (3)糖类衍生物,比如Octyl glucoside, (4)聚乙氧乙醇基团, 比如Triton X-100和NP-40。 Triton X100和NP40大家都用得比较多。 它们实际上是同一种去垢剂，疏水基团是取代苯基，而亲水基团是聚乙氧乙醇基团。我想强调的一点是，聚乙氧乙醇基团与氧气很容易发生反应形成过氧化物, 如果用在蛋白质纯化里面，很有可能会破坏蛋白质的活性。所以一般商业化的,比较纯的NP-40和Triton X-100都是小包装，而且在包装瓶子里面充有惰性气体。 选择适当去垢剂来纯化膜蛋白，有一些实际问题必须先想好。我强烈建议大家以后选择和使用去垢剂的时候先考虑以下几个问题： (1)选择的去垢剂是否干扰蛋白质浓度的测定？ 类似于Triton X100之类的去垢剂有苯环结构，所以在280nm有很强的吸收。而相比之下CHAPS和胆酸钠之类的去垢剂就没有这个问题。另外，有些去垢剂会严重的干扰一些protein assay。比如常用的Bradford assay，用的是commassie blue G-250染料。这种染料在酸性条件下呈现为褐色胶体物质，但在与疏水物质结合之后会变得稳定而呈现蓝色。所以可以想见，这种染料不单能染蛋白质，也能染一些去垢剂。我们在实验一开始专门做了测试，发现Triton X100和sodium cholate对Bradford assay 干扰比较严重，chaps, 尤其是Octyl glucoside基本上没有什么干扰。遇到这种干扰问题，要么换去垢剂，要么换protein assay方法。 (2)是否需要在以后的步骤里面去掉或者置换掉去垢剂？ 去掉或者置换掉去垢剂是一件很麻烦的事情。因为很多去垢剂会形成胶束结构，分子量非常大，所以没法用简单的透析或者超滤来去掉。比如大家常用的Triton X100和NP40, 单体分子量是628,胶束的单体聚集数是140, 所以胶束的分子量有87KD了,这显然是没有办法用透析来去掉的。相比之下CHAPS单体分子量615,聚集数是10, 胶束分子量只有6KD,用透析就很容易去掉了。 (3)是否需要在以后的步骤里面用到离子交换层析或者疏水作用层析？ 离子型去垢剂会与相应离子交换柱结合得很好，干扰蛋白质的纯化。所以如果要用到离子交换柱，要用非离子型或者两性离子型的去垢剂。另外，由于去垢剂有疏水基团，一般用了去垢剂之后，就不应该在后续步骤里采用疏水作用层析的方法了。 (4)如果在后续步骤中选用凝集素层析, 选用的去垢剂是否构成干扰？ 凝集素是一种植物中提取的一系列可以与糖基结合的蛋白。因为很多膜蛋白都有糖基修饰，凝集素层析可以利用这种性质来纯化一些膜蛋白。类似与Octyl Glucoside的去垢剂，亲水基团是糖或者糖的衍生物，有可能与凝集素结合，降低凝集素的纯化效果。比如ConA agarose常常被用来纯化具有High-mannose type N-glycan的蛋白质，与mannose和glucose都能结合。如果此时用Octyl glucoside，就无法纯化蛋白了，因为Octyl glucoside的亲水基团是一个glucose。 (5)是否需要用弱的去垢剂来去掉soluble protein? 有时候用去垢剂并非完全是用来溶解膜蛋百，其实也可以用来去掉一些可溶蛋白杂质。比如Sodium cholate是一种很弱的去垢剂，虽然不能用来很有效的溶解insulin receptor之类的膜蛋白, 但是可是用来处理plasma membrane prep, 去掉大量的可溶蛋白杂质。 (6)是否需要用去垢剂来做Two phase partitioning？ Triton X114是一种很特别的去垢剂，在室温下很容易溶解在水中，但是在３０摄氏度以上会从水相中脱离出来，并且连带的把膜蛋白也一起拽出来。这样呢，就可以把膜蛋白和可溶蛋白分开。这种方法叫做，two phase partitioning。我并不太喜欢这种方法，因为有一组人做了这个实验，感觉分得并不是那么干净，在可溶相还是有不少insulin receptor。 (7)去垢剂的用量是否足够? 要充分的溶解膜蛋白，去垢剂的用量必须足够才行。我们在试验中，先测了一下起始样品的蛋白总浓度，然后以detergent : protein 5:1的比例加去垢剂。 (8)选用的去垢剂是否影响所纯化蛋白的活性？ 有些情况下，某些十分娇贵的蛋白质对一些去垢剂很敏感。问题是,很难预先就知道那种去垢剂会降低蛋白活性。但是，我觉得大家至少得意识到，去垢剂很有可能干扰蛋白活性的。我举一个例子。我是做糖基转移酶的。有一种酶叫Protein O-mannosyltransferase 1 是一种膜蛋白，跟muscular dystrophy有关系，是一个研究热点。很多实验室都怀疑这种蛋白是糖基转移酶，但是很长一段时间里面，很多实验室发现表达的重组蛋白都没有活性。一直到前两年，终于有一个实验室证明了这个蛋白是有活性的。之所以很多实验室之前都不成功，其中一个重要因素就是去垢剂。Triton X100和NP40是很常用的去垢剂。这个成功的实验室发现，如果用常规浓度下的Triton X-100，表达的Protein O-mannosyltransferase完全没有活性，相比之下用了Octyl thio-glucoside就有活性了！所以呢，如果大家试图表达一个膜蛋白，却没有活性，不妨换一下去垢剂，说不定会有意外的惊喜。 （十八）凝集素层析 我们用去垢剂溶解了膜蛋白之后，紧跟着的一步就是用Wheat Germ Aglutinin(WGA) agarose来部分纯化insulin receptor。WGA是凝集素(Lectin）中的一种，而Lectin指的是可以与糖基结合的蛋白质。现在常用来做蛋白质纯化的凝集素绝大部分是从植物中提取出来的。绝大部分膜蛋白的extracellular domain和分泌蛋白都有N-linked glycan 的糖基修饰。根据这个性质，用固定有适当的凝集素的beads，比如WGA agarose或者ConA agarose可以部分提纯膜蛋白。注意，只能是部分提纯，凝集素层析并不能一步登天，让蛋白质比活力一下子提高上千倍，至多几十倍就已经很不错了。但尽管如此，凝集素层析是一种很好的办法，因为buffer条件非常温和，洗脱液是加了糖的buffer，透析什么的也方便，非常非常适合于和其他层析方法偶连起来用。 纯化膜蛋白用的最主要的两种凝集素是WGA和ConA。谈到这里，我先向大家介绍一下N-linked glycans。N-linked glycans 是哺乳动物细胞中最常见的一种糖基修饰。 这种糖基是加在膜蛋白的extracellular domain 上面。如果膜蛋白有这个sequence, N-X-S/T , 最前面的Asparagine多半被N-glycan修饰。N-glycan是一个Oligosaccharide 结构，好像一个分叉的树枝一样。膜蛋白的新生肽链在被翻译合成的同时会被直接塞入ER lumen，同时就会被加上一整个树枝状的N-glycan core。这个N-glycan加上去之后，并不是就大功告成了，而是要经历一系列“裁减”，有的糖基会被去掉，新的糖基又会被加上，这样最后的N-glycan structure往往是千奇百怪。 但是N-glycan的“主干”都是相似的. Man Man \ / \Man/ | GlcNAc | GlcNAc | N-X-S/T Man代表Mannose甘露糖，而GlcNAc代表N-乙酰葡萄糖胺. 保留在ER或者Cis-Golgi的膜蛋白,N-glycan往往是High-mannose type。在这种N-glycan的末端有很多甘露糖(mannose)修饰。最适合于纯化这种蛋白的凝集素是ConA。ConA主要识别alpha-mannose, alpha-glucose和alpha-GlcNAc,所以可以这三种糖溶液来做洗脱液。分泌出去的蛋白，或者已经到细胞表面的膜蛋白的N-glycan往往是complex type。这种complex type N-glycan的末端往往修饰有Sialic acid（唾液酸，一种带负电的糖）和GlcNAc。而WGA主要识别GlcNAc和Sialic acids，所以特别适合于纯化这种类型的蛋白，洗脱液可以用GlcNAc和Sialic acid溶液。 最后需要指出来是，纯化一种特定蛋白，选择用什么凝集素是完全经验性的，需要提前测试才知道的。 （十九）MDA-BF-1的启示 凝集素层析实际操作起来很简单，跟过简单的Ni柱子一样。拿到洗脱的蛋白之后，我们就着手开始测活，分析纯化的效率和倍数。胰岛素受体不是酶，所以测活是利用胰岛素与受体的特异结合。具体的测活步骤非常简单，就是把I-125标记的胰岛素和纯化的组分混合然后孵育一段时间。然后加PEG（Poly ethylene Glycol ) 6000沉淀胰岛素受体，而游离的胰岛素不会被沉淀下来。说到PEG沉淀，Dr.Lin讲了她自己闹的一个笑话。是这样的，她实验室发现了一个蛋白质因子 MDA-BF-1。这个因子对Osteoblast（成骨细胞）的增长有促进作用。 然后呢，她就想把这个因子的受体给找出来。首先一步呢，就是得有一个测活方法。所以她就比照insulin receptor的测活方法而设计了一个方法, 其中连PEG沉淀都是一样的。结果呢，这个测活试验完全失败了。问题出在PEG沉淀这一步。PEG作为一种多元醇，可以想像为一种“分子海绵”，可以吸附水分子。这样样品中蛋白的有效浓度实际变大了好多，容易出现聚集然后沉淀的现象。这就是为什么insuline receptor可以被沉淀下来的原因。而游离的胰岛素本身分子量很小，只有不到10KD，而且非常易溶，所以即使加了PEG，也沉淀不下来。而Dr. Lin发现的MDA-BF-1因子，分子量相对insulin大了好多，有50多KD，所以游离的因子也能被PEG沉淀下来。听完这个小插曲，我感觉挺吃惊，作为一个有经验的教授，Dr.Lin在没弄清楚原理的情况下竟然就胡乱套用protocol 。所以呢，我感觉做实验，仅仅是follow protocol把实验完成了，是远远不够的。一定得搞清楚原理是怎么回事，这样出了问题才知道怎么去改进。 MDA-BF-1不仅仅给我以上的启示。Dr.Lin给我们做了一个seminar， 讲述她的研究进展。 其中她重点谈到了MDA-BF-1这个因子。 她实验室现在正在做的是试图用蛋白质纯化的办法来找出MDA-BF-1的受体。她的测活方法是这样的，首先表达MDA-BF1的重组蛋白，然后用同位素标记，然后做binding assay。这个binding assay 很麻烦，因为没办法用简单的手段把游离的MDA-BF-1和与受体结合上的MDA-BF-1分开，只能用gel filtration column来分开，每做一次assay都很麻烦。虽然Dr.Lin提到她们还没有找到那个受体，我个人觉得这个方法不是很明智。为什么呢?纯化 蛋白的过程中，各种膜蛋白都处于一种被去垢剂溶解的匀浆状态，这种情况下，一些正常生理条件下不会与MDA-BF1结合的受体可能也会与其结合。 这样一来，纯化出来的东西就是乱七八糟的了。另外一种可能性是: 有很多膜蛋白能与MDA-BF-1相互作用， 但是只有一种膜蛋白能够启动下游的信号传导， 促进Osteoblast的增长。这种binding assay的测活方法虽然可以找出与MDA-BF-1结合得最好的膜蛋白，但是找出的膜蛋白可能根本没有信号传导的功能。需要强调的是，蛋白质纯化绝对不是万能的。要想纯化出一个未知蛋白，最最重要的是要有一个简单明了直接的测活方法。Dr.Lin 实验的问题，说到底，就是没有好的测活方法。 这一个模块的纯化试验到此就为止了。我们测活之后，比较了各种去垢剂的纯化效率，发现Triton , CHAPS, Octyl Glucoside都还比较好，Sodium Cholate则差好多。 原始的实验手册上还有进一步的insulin affinity chromatography和其他分析。而教员为了满足很多学生做做重组蛋白表达纯化的愿望，用一些比较白痴的的实验取代了原有很经典的实验。比如一个实验是从SF9里面纯化一个his tag的蛋白&%$&$#$#!!! 我知道要做这个试验之后，几乎要抓狂了。我这一组其他几个人还把这个试验当宝，抢着做。而我最后选择去跑了一个2D gel。就这样，第三个模块的实验结束了。 （二十）钙调蛋白 纯化胰岛素受体的模块结束之后，我们这一组人进入到最后一个模块，做钙调蛋白的纯化和分析。钙调蛋白(Calmodulin)十分重要，几乎在所有真核细胞里面都能找到。这个蛋白只有148个氨基酸，大概16KD，比较小。有Ca2+结合的情况下，钙调蛋白的构象可以发生较大的改变，从而激活一系列酶的活性，比如cyclic nucleotide phosphodiesterase, 一些protein kinases, phosphatases 和ATPase等等。这一个模块的实验中，我们是从鸡胗里面提取和纯化钙调蛋白，然后再做一些分析。 这一个模块的纯化设计，可以说是最大限度的利用了钙调蛋白的特殊性质，我觉得设计的很精彩。不过我对这个模块的实验经历并不是很满意。教员的实验助手只有一个人，而且非常不称职，对实验本身似乎不太了解，也不是很helpful，感觉比前几个模块的实验助手差多了。教员叫Constantin，是一个俄罗斯人，在rutgers当教授。我起初对他印象不佳，后来发现这个人其实很nice,非常和蔼。 整个纯化步骤大概是这样的。首先把鸡胗剁碎匀浆，然后做粗分离，用硫酸铵沉淀的办法把杂蛋白都沉淀下来。然后再做等电点沉淀，把Calmodulin沉淀下来。重溶沉淀之后再做透析来脱盐。然后再过阴离子交换柱DEAE Sephadex A-50。纯化出来的组分再过疏水作用层析柱，就可以得到很纯的Calmodulin了，用Commassie blue都可以染出来。 我们做的实验中没有对Calmodulin的测活实验，可能是因为最后纯化出来的Calmodulin很多,可以做光谱分析之类的实验进行分析，所以就省掉了。但我多少有一点本末倒置的感觉。因为对未知蛋白质纯化，首先就得有一个靠的住的测活方法, 然后才能逐渐制定最优化的纯化策略。另外，在设计测活方法之前，还必须搞清楚，有生物活性的物质是不是蛋白质。一般有下列几种方法。(1)对protease的是否敏感。(2)生物活性不会因为透析而丢掉(3)Urea之类的变性剂是否降低生物活性(4)对化学修饰剂(比如sulfur hydryl blocker idoacetamide)是否敏感。 我们提取钙调蛋白所用的组织原料，鸡胗，量挺大的，有一斤之多，红红的一大堆肉。这样的组织，匀浆是一件很麻烦的事情，所以我们用了一个大号的匀浆机，试图把肉都捣烂。但是效果不好，重复了两次，还是有很多肉没有被弄碎，所以只好扔掉了。值得强调的是，对于这样大量组织的匀浆，缓冲液的配方必须有所考虑。首先，离子强度要低一点，高离子强度容易导致蛋白质聚集和沉淀；其次，最好加如EDTA之类金属离子螯合剂。这是因为组织里面会有很多二价阳离子，有可能会与组织里面的一些无机盐（比如磷酸盐）反应产生沉淀，导致匀浆中蛋白质不能完全溶解。最后，如果要在后续步骤中过阳离子交换柱，要避免有primary amine的缓冲物（比如tris），如果要过阴离子交换柱，则要避免用磷酸buffer。 我们拿到匀浆之后，然后过滤。接着的一步就是硫酸铵沉淀。硫酸铵沉淀的原理我前面提到过，所以就不多说了。我们用了饱和硫酸铵浓度（６０％）来沉淀。 钙调蛋白这个东东很奇怪，没有钙离子结合的情况下很亲水，所以即使用饱和硫酸铵，也沉淀不下来。但大量的杂蛋白都能被沉淀下来。当然也不是所有的杂蛋白，至少血红蛋白就不行，因为硫酸铵沉淀后的上清还是红色的。下一步呢，就是等电点沉淀。钙调蛋白是一个很酸的蛋白，等电点只有4.05，所以可以加硫酸使pH降到4.05附近，蛋白总电荷为零，就容易聚集沉淀。我的感觉是，等电点沉淀并不是很可靠的方法，因为很难保证沉淀过程中蛋白会不会变性。搞不好，蛋白沉淀后就没法重溶了。钙调蛋白溶解性比较好，也比较皮实，重溶起来比较容易。重溶用的是Tris的溶液，由于这个时候样品溶液里面盐浓度很高，不能直接上样到下一步的离子交换柱上，所以需要透析。我们先把样品放到蒸馏水中透析两三个小时，然后再换到一般的缓冲液里。透析大家估计都熟悉，也没有什么技术含量。只有两点值得注意，首先，透析袋不能装满，因为透析过程中样品体积会增加。其次，透析袋空的地方要弄瘪，不能留空气，否则样品体积增大后，扎紧的透析袋可能会受压而破裂。 |
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