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药物表型筛选
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表型是具有特定基因型的个体，在一定环境条件下，所表现出来的性状特征的总和。药物表型筛选是基于特定环境下，表型改变的一种筛选方法。药物的表型筛选经历了漫长的时间。传统的药物表型筛选更多的是基于动物疾病模型的筛选，通过观测药物对机体表型的改变。随着技术的进步，可以在更深的层次上研究组成生命体的微小元件，如细胞、蛋白、基因等等。 1. 动物疾病模型的药物筛选 作为经典传统的药物表型筛选方法，目前仍然有巨大的应用空间，进行药物活性筛选，有时候为了更好的观察药物的效果，需要进行体内实验，这就需要到实验动物了，而如何选择合适的实验动物呢，往往获得信息很杂乱，都片面化。所谓的实验动物是需要遗传背景明确或者来源清楚的动物。实验动物根据药物药效和给药方式的不同，选择不同的模型。主要的有鸡、猪、狗、猫、鼠、蛙、蛇、猴子、鱼、果蝇、线虫等。由于药物筛选通常涉及的药物比较多，以万为单位的筛选，通过其他方式缩小范围后，至少也有几百个化合物的体量，从经济成本与时间成本看，采用模式动物进行药物筛选最多的就是小动物了，比如线虫、果蝇、斑马鱼，大小鼠等。 1.1 果蝇 优点： 果蝇是一种真核多细胞昆虫，体型较小，身长3～4mm，其作为模式生物的优势体现在易饲养、生长周期短、繁殖力强、雌雄易分辨等方面。 1 易饲养果蝇的饲养所需空间较小，所需的设备也仅仅是一个模拟人工环境的培养箱; 用于饲养果蝇的培养基有多种，原料也很常见，因此饲养果蝇的成本很低。 2 生命周期短和繁殖力强果蝇的生活史包括卵期( 胚胎期) 、幼虫期、蛹期、成虫4个阶段，在25 条件下，从卵到成虫只需10 d 左右，成虫的寿命一般为6 ～ 8 周，因此果蝇生命周期短。一对果蝇交配后10 ～ 20 d 可以产生数百只基因完全相同的后代，其繁殖力和传统的动物模型(只有少数3 ～ 4个月能产生后代)相比，速度快且量大。 3 雌雄易分辨雌雄果蝇差异明显，通常情况下以肉眼观察有无黑斑，即可辨别雌雄。对于羽化时间短的果蝇，在显微镜下观察其末端，就能辨别雌雄。未交配的雌虫容易辨识，方便后续杂交试验和产卵量测定等实验。 4 模型多在果蝇生命周期的4个阶段，每个阶段都具有其独特的优势，可作为模型用于不同的研究目的。果蝇胚胎期用于研究发育，如器官形成，神经发育和轴突的形成。果蝇的幼虫，特别是第三龄幼虫，具有自主爬行能力，通常用于研究觅食行为等生理过程。果蝇成虫的大脑非常复杂，可以调控很复杂的行为，包括昼夜节律、睡眠、学习和记忆、求偶、觅食、侵略、美容和飞行导航。此外果蝇还具有与哺乳动物心脏，肺，肾，肠以及生殖道相同功能的结构，可用于相关研究领域。 5 给药途径多样果蝇给药途径很多，胚胎可应用渗透法给药;幼虫可通过将药物添加到固体培养基中给药; 成虫可以通过蒸汽( 如乙醇和可卡因) 、添加到培养基、蔗糖/药物饱和滤纸以及注射等方式进行给药。 用途： 果蝇作为模式生物已广泛应用于衰老、神经退行性疾病、失眠、肿瘤、肥胖和心血管疾病等研究领域。 1.2 鼠类 这个类别应该是目前应用最广泛的动物类别，目前有90%以上的动物实验涉及到鼠类。不同的鼠的应用又各有差异。 1、小鼠 优点： 体型小，生长期短，成熟期早，性情温顺、繁殖力强及易操控 用途： 免疫学、遗传学、药效学、毒理学、药代学等待研究。 2、大鼠 优点： 体型适中，性情温顺，采血量大及生育能力强。一只大鼠通常可以提供足够的一般实验分析需要的血液和体液，易于实验操作 用途： 免疫学、遗传学、药效学、毒理学、药代学等待研究。 从中我们看出大小鼠貌似没啥差异，但是在具体实验中，差异还是蛮明显的，小鼠or大鼠的选择根据自己实验目的哈。 1.3 鱼类 本次讲的鱼，就特指斑马鱼了哈。 优点： 斑马鱼(zebra fish) 作为一种常用的模式动物，普遍用于脊椎动物的发育、疾病机制研究等。别看它是水里游的鱼，可是其基因组和人类具有很高的同源性，并且已经全部完成测序，此外具有繁殖周期短、便于遗传操作等优秀特质，因此应用于越来越多的科研领域。近年来，斑马鱼的应用领域涉及很广，包括：早期发育研究、功能基因研究、肿瘤相关研究、药物筛选、药物毒性测试、环境毒性测试、损伤修复等。 斑马鱼个体小，成鱼体长3-4cm，幼鱼体长只有1-2mm，可以使用96孔或者384孔板进行操作，适合高通量分析。 饲养成本低，占地空间小（200平米空间可养殖50000只成鱼），药物用量少（μg级），仅为鼠类实验的1/100至1/1000。 用途： 药物开发：斑马鱼可用于药物开发的多个阶段，如：靶点确认（基因功能研究），高通量药效与安全性筛选，先导物优化，药物毒性与安全性评价，老药新用（临床新适应症开发）等等。基础研究、环境监测与化学品风险评估。 至于还有其他的物种就不叙述了，应用范围不广，比如猴子等，好贵呢，由于体内筛选确实比较费钱费力，通量也小，只能对很少量的化合物进行活性筛选，存在这样那样的一些缺点，为适应更为广泛和快速的药物筛选方法，发展起来的基于体外的药物筛选方法，也就是现代的药物表型筛选方法逐渐成为了主流。 2、体外药物筛选 表型筛选中的体外筛选，通常以细胞作为筛选工具，优点是对于靶点还不明晰，或靶点与疾病之间的关系还不明确时的药物开发，具有非常好的效果，常用于First-in-class药物的研发。 1999年到2008年FDA批准的新药统计分析表明：基于靶点的筛选尽管在follower跟踪类药物的审批中占有优势，但是在first-in-class原创新药的发现上只有17个，而非主流技术“基于表型的筛选”first-in-class却有28个。基于表型的筛选在first-in-class原创新药开发中具有明显优势。学术界和产业界开始质疑基于靶标的筛选虽然有其优势，但也可能限制了药物发现的范围。而基于表型的筛选在药物发现中正卷土重来，并激起了激烈的争议。诺华和葛兰素史克公司是积极拥抱这种回潮的拥护者，而罗氏和基因技术公司似乎对此疑虑重重。值得注意的是，无论是学术界还是产业界，无论是赞成基于表型筛选的诺华和葛兰素，还是反对者罗氏和基因技术公司（Genentech），都源自基于表型筛选获得活性化合物后如何实现靶标鉴定这一问题。活性化合物的发现与靶标的鉴定两者问实现无缝对接是学术界和产业界关注的焦点和难点。靶标的鉴定的新技术己经成为能否让基于表型的筛选重新受到学术界和产业界的青睐，夺回被基于靶标的筛选侵占的主导地位的关键，推动药物研发革命的关键。这一现象重新激起制药行业和科研工作者对表型筛选的兴趣，期望通过现代表型筛选来提高早期药物发现和晚期药物开发的成功率。而且，现代表型筛选对一些病因不明、缺乏有效治疗药物的罕见病的药物开发具有更重要的意义，也可应用于新颖药物靶点的发现。 图一 1999-2008上市药物的发现方法总结 2.1 材料 目前，表型药物筛选重新受到重视，并被赋予新的内涵，形成了现代表型筛选(modernphenotypicscreening)。随着生物学研究相关技术和仪器设备的迅速发展，现代表型筛选与传统表型筛选（动物水平）有些不同，可涉及更多更复杂的生理和病理过程，通过细胞水平的表型改变来筛选发现新型药物。基于细胞表型分析通常使用的材料大致有以下几种： 1、原代人类细胞株 2、永生化细胞系（原代或工程化） 3、自患者或正常人类原代细胞 4、被诱导的多能干细胞（iPSCs）分化的特定细胞类型 2.2 实验 常进行三种类型是基于细胞表型分析细胞活力测定法，细胞信号通路分析，和疾病相关表型分析。根据细胞单一的生理反应进程可以将细胞的功能学检测方法分为4大类。 1、以细胞整体为研究对象，测定化合物作用后的最终响应情况，测定候选药物引起细胞整理水平的变化，如细胞状态检测、分泌物检测。 2、接收信号通路中的初始变化，测定候选药物引起靶点蛋白最初的变化，最常见的是候选药物和位于细胞膜上的靶点受体的结合，或者阻断靶点受体和天然配体的结合，如靶点蛋白结合。 3、接收信号通路中信号放大变化，测定信号转导过程中信号通路中关键生物标志物的浓度，如第二信使或者激酶测定。 4、分析信号通路分析转录情况，测定引起细胞应答的转录和翻译水平的变化。 基于细胞表型分析的药物筛选是处于复杂的蛋白相互作用和信号网络的生物环境，更接近于人体，与基于靶标的药物筛选相比，是目前药物表型筛选的主流。与体内筛选相比，首先，首先降低了筛选样品的用量。用整体动物进行药物筛选，对样品的需求量一般在1-5g以上(根据用量和动物大小)，而采用体外筛选模型筛选药物，样品用量一般仅需整体动物的1/10-1/100或更少；第二，降低劳动强度，扩大筛选规模，减少动物用量，特别是有些模型仅使用一小部分组织或者细胞，同一时间内可以进行多样品的筛选，提高了筛选效率，降低了筛选成本。第三，减少了影响药物作用的因素，易于评价药物作用。第四，细胞、分子水平的药物筛选模型具有材料用量少、药物作用机制比较明确、可实现大规模的筛选等特点，已经成为目前药物筛选的主要方法。第五，细胞分子水平药物筛选模型的应用为自动化操作奠定了基础，使药物筛选由传统的手工筛选形式转变为由计算机控制的自动化大规模筛选的新技术体系，形成了高通量药物筛选。第六，是大样本量的筛选，由于药物筛选是对未知的探索和发现过程，只有扩大筛选对象和筛选范围，才有可能发现真正高水平的药。实现了一药多筛，由于这类筛选模型消耗样品很少(μg级)，可以使珍贵的样品在多个模型上进行筛选，扩大发现新药的范围。这种筛选方法符合药物筛选和药物发现的基本规律。 同时呢，事物都是有两面性的话，也有其缺点，其一，细胞不能模拟人体的药物吸收、分布、代谢和排泄过程，以及体内的毒性，导致很多体外有生物学效应的化合物在体内效应不一致。其二，在于作用机制不明晰，因此后期还需要复杂的机制研究。 参考资料： 1、准确快速实现表型筛选所获得活性化合物药物靶点鉴定的方法 王立顺、韩冰、黄黎莹 2、现代表型药物筛选———药物发现的有效途径 王月华、杜冠华  上市药物的发现方法总结.jpg |
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