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生物小虫007

新虫 (小有名气)

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[交流] Pacbio iso-seq全长转录组测序tips

近年来，随着高通量测序技术的发展，转录组测序已经成为研究基因表达调控的主要手段。但二代的转录本重构准确率很低，三代可以直接得到全长转录本，无需组装。可改善基因表达定量结果，发现新的基因和转录异构体，鉴定可变剪切及基因融合现象。全长转录组测序已经越来越多地被应用到基因组学和转录组学的研究中，以下整理了一些关于pacbio iso-seq 实验相关问答：
1，iso-seq 的建库类型有哪些？
   目前三代 iso-seq 的建库过程涉及到对 4kb 以下和 4kb 以上的片段分别进行筛选,然后将 4kb以上和 4kb 以下的转录本进行混合构建 1 个三代全长转录组文库，这也是目前 pacbio 官方推荐的主流建库方式。
2. 如果我构建两个文库，是一个库生成一个文件吗？还是混合文件？
   三代测序是一个 cell 对应一套测序结果文件，每个 cell 都有单独的结果文件，如果两个库分别测序，则是一个库一个文件。
3. 三代的数据能不能拆分？
   三代测序支持混样测序（加 barcode 方案），但目前在全长转录组测序中应用不多，因为三代本身一个  cell 的产量在 6~10gb 左右，刚好适用于一个样品的测序数据量没必要进行混样测序。另外目前混样测序数据拆分比例不高（60%左右）会造成数据量的浪费。
4，pacbio iso-seq可以做转录本定量吗？
   pacbio iso-seq 对每个样本通过构建多个不同片段长度的文库，对每个片段的文库也测了不同的深度，最终每个文库进行合并分析，因此就比较困难像二代测序一样对数据进行均一化来评估表达水平的rpkm/fpkm。
5. 如何选择测序样品？
   总体原则是根据研究目的进行选择：如果是希望获得尽可能全面的转录本，换句话说，就是想要获得该物种转录组水平的参考序列信息；那么我们建议对该物种的不同部位混合取样。如果只想研究某个特定的组织部位，那么建议在不同发育时期对特定组织部位进行取样。
6. 如何确定测序的数据量？
   数据量大小依据物种的复杂程度、基因大小及研究目的来确定。根据已有的项目经验、数据库信息及文章报道，我们推荐：普通动植物，研究中、高丰度的转录本，测序量8g及以上（单个样本测8g，构建3个文库）；多倍体、高杂合的基因组较大的物种，研究中、高丰度的转录本，测序量16g及以上；检测低丰度的转录本，测序量20g以上。
注：混合样品要相应增加测序量，如果所研究物种有参考信息，可根据参考序列信息进行个性化评估，推荐测序数据量及构建文库个数。

[ Last edited by 小冀- on 2019-7-24 at 09:26 ]

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