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dlyxy5881新虫 (小有名气)
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酶切后为什么总连不上？？
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| 载体是pet28 ,目的片断是2500bp，双酶切后切胶回收条带大小正确，亮度也可以，连接体系是10ul，载体与目的片断1：3，过夜，16度，涂板 后要么不长，要么就2个左右，请问这到底怎么回事，该从哪些方面考虑原因？？ |
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amisking(金币+1,VIP+0):感谢幸苦劳动，建议整理后再发！鼓励一下！ 5-28 12:07
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酶切连接不上原因很多 以下是转的，希望对我们大家都有用 双酶切连接反应之全攻略 前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了 很多次，不过很快改善了 实验方法，用2周重组了 14个质粒。现就自己的体会，结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。 1、 回收PCR产物 在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的 选择非常重要，尽量选择粘端酶切和 那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。 纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒 酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。 而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的 因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的 质量好，酶切完全切得动。 2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接 摩尔比的计算：很多人凭经验也可以，但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。 pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg，也可以直接用这个公式套。1pmol 1000bp DNA=0.66μg，如载体是5380bp，则0.03pmol为 0.03×5.38×0.66=0.106524µg。 测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0。另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的MARKER每个条带约50ng。 连接反应：TAKARA的 连接酶上的 说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。 3、转化 a、全量（10 μl）加入至100 μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。 b、42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。 c、加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。 取100μl铺板。也可离心后余100μl 几个非常重要的问题 1）做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解，为保险起见，一般连接3小时，16度。 2）对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时,注意加AMP时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来。我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度，铺板前后注意用吹风机吹干。 3）对照的设立 为验证双酶切是否成功，可做如下对照： A 酶切反应时加各单酶分别切，两管，用同一种BUFFER，跑胶，看单切的两管是否成线性。如两管均成线性可初步判断双酶切成功。 做转化时，也要进行对照，设4个： A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应，这个对照可进一步看双酶切是否成功,如果长出克隆，说明很有可能只进行了单酶切，如没长出克隆，则证明双酶切成功，当然要保证感受态，培养基，连接酶都“正常”的情况下。 B.酶切过的未进行连接反应的双酶切产物，进行转化，这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒 C.设原始质粒为对照，意为检测整个操作过程中是否有误。 D.AMP阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够，检测感受态状况。 （就上面的对照简要说一下我的结果：转化后第二天可见14个标本的平皿上长了很多克隆，约100个左右，我用的是直径6cm的板子，所以仍显较多，（我是先挑半个克隆并标记好行PCR鉴定后再对另外的一半进行摇菌抽提质粒），较难挑克隆，所以铺皿时不用离心，直接用100微升的铺皿就可以了，我其中一个是这样做的，长得克隆较大，很好挑选。 下面简要的说一下对照的结果。 A 只长出了3个克隆，以100的基数计算，约为3%。即双酶切反应中质粒只有3%进行了单酶切 B 约有5个克隆，即质粒完全没被切动的约5% C 长了很多克隆，证明操作系统没有问题。为系统控制指标。 D 长了很多克隆，证明感受态没有问题。 这些对照相辅相成，扬长避短。万一什么都没作出来，也好分析原因。） 4）所有的试剂切记低温保存，一步一个脚印，不要偷懒，图省事最后却更费事，注意设立对照。 经PCR鉴定，克隆90%-100%的阳性率，所以在后面的挑克隆中，我只挑选4个就足够了。然后双酶切鉴定，测序。 ________________________________________ 连接前最好将水、插入片段和载体混合好以后置于45度水浴5min，马上置于冰上冷却，再加入buffer和ligase。 ________________________________________ 这个操作是什么原理？为什么要选择45度？ ________________________________________ 其实也不一定45度，估计50度也行，45度对于几个碱基结合（酶切位点）的打开绰绰有余。 分子克隆3的经典操作，个人认为主要目的如下：插入片段和载体在之前的操作过程中有部分粘性末端已经匹配，如果直接连接可能会有多重插入和多载体自连的情况，45度处理是其粘性末端打开。由于片段与载体混合、预热后马上置于冰上，使得片段与载体最大限度匹配，从而提高连接效率。 ________________________________________ 刚才查了一下分子克隆3，只说了一句“以消除重新复性而导致的末端相互聚合”。 |
5楼2009-05-28 11:44:45
susizheng
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