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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助：关于质粒双酶切
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xj22667

银虫 (小有名气)

[交流] 求助：关于质粒双酶切

最近做克隆，需要用到pET载体，由于酶切位点和师姐以前构建的质粒酶切位点一样，故拿她的质粒来双酶切，所提质粒纯度较好，但酶切过夜后，电泳检测竟然没有片段，胶上模糊成一大片（是切过了吗？？？），故将酶切时间减少到5h，电泳检测还是一样的结果，请各位高手指点迷津！！！
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1楼 2009-05-27 19:10:19
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+1,VIP+0):有道理！ 5-27 20:39
1、有没有把没有切过的质粒拿去跑一下，有可能是切之前就已经降解了
2、酶切5h？？？也是过火了，按照酶活定义，1h切1ug，现在也好多快速内切酶可以5min达到同样的活性。
3、考虑加的酶量是否过多或者buffer是否用错，排除星号活性的可能
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2楼2009-05-27 20:27:35
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shisanliu

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我认为最重要的还是先前的质粒模板呀  你可以先看看模板有问题没   再次 如果没问题 你可以先用单酶切看看  酶切时间过夜 或者5个小时  应该影响不大    估计90的可能处在模板上面
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3楼2009-05-28 03:22:27
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xj22667

银虫 (小有名气)
质粒提好后我跑过电泳，很亮 而且只有一条带  我准备拿pET原载体来切试一下
感谢各位的热心帮助
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4楼2009-05-28 11:32:58
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