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xiaomu3811金虫 (小有名气)
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| 请问菌种鉴定的时候为什么要做16sRNA的测序呢？什么原理啊？谢谢！ |
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2楼2009-05-25 20:16:18
xiaomu3811
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3楼2009-05-25 20:21:10
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yuanbo934
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由于核糖体是细胞结构的重要组分之一，且原核生物中的16S rDNA 分子量大小适宜，含有的信息量很大，而且碱基序列能够遗传稳定，高度保守，所以它常常被用于鉴别生物间的进化关系[48，49]。目前，土壤微生物多样性的研究也广泛地利用16S rDNA 基因序列进行研究，从而为未知菌的鉴定和微生物的系统发育分析提供了全新的方法，并取得了良好的结果。Woese 等利用16S rDNA 序列分析技术，发现，古细菌与其它细菌在系统发育上存有很大差异的一类微生物，即，为有关真细菌、真核生物和古细菌 “三域”理论奠定了基础[50]。 从环境样品中提取的微生物的总DNA 作为模板，对16S rDNA 基因进行PCR 扩增，然后与已建立的16S rDNA 基因序列数据库进行比对分析，从而来确定细菌的系统发育关系。这种方法不依赖于传统的细菌分离培养，能够真实地全面地反应环境中微生物的群落结构。16S rDNA 基因序列的分析方法被广泛应用于对各种环境样品的微生物的群落结构分析中，其中包括土壤、湖泊、海洋、活性淤泥及沉积物等。 目前，16S rDNA克隆文库的构建可以通过有多种试剂盒来实现，如TA克隆试剂盒[51]和 pGEM-T试剂盒[52，54]。在构建文库之后，通常采用质粒提取方法或全细胞PCR扩增获取质粒中的16S rDNA序列[52]。质粒提取方法虽然工作量较大，但能够得到质量较好的质粒，产物可以直接用于DNA测序。全细胞PCR扩增是利用载体序列上已有的位于多克隆位点两端的引物，以直接挑取的单克隆细胞作为模板进行PCR扩增，从而能够得到插入质粒中的16S rDNA片段序列。但全细胞PCR扩增得到的PCR产物通常需要纯化后才能用于测序。为了使获得的序列具有代表性，通常需要选取至少50个左右的单克隆进行序列回收[53]。回收的得到序列要全部进行测序，以便能够更好地进行微生物分类分析。但有时由于测序费用高昂，所以不能将所有回收的序列进行全部测序，则需要先把重复序列剔除后，然后将具有代表性的序列进行测序。 应用已建立的16S rDNA 基因序列数据库，将测序后获得的序列在数据库中进行序列比对，这样就可以确定与其亲源关系最接近的菌株的系统进化地位(即nearest neighbor taxonomy)，通过对所有序列的进行分析就可以反映出土壤样品中的细菌群落组成结构。现在，人们已经测定了大量的16S rDNA基因序列，并构建了一个庞大的16S rDNA 基因的数据库，它常被用来分析这些序列，即RDP数据库(Ribosomal Database Project Ⅱ，http://rdp.cme.msu.edu/html)。 |
5楼2009-05-25 22:17:25
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