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guzijing

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[资源] 免疫组化详细步骤，浅谈多指教

免疫组化

一．固定、脱水、包埋

1.取组织放入4%多聚甲醛里面固定3-4小时，时间根据标本大小适当调整。

2.取适当大小组织放入包埋盒中，进行脱水。每个染缸液体体积约200ml，每次脱水可以装20个包埋盒。依次进入：

75%酒精1.5小时、95%酒精1.5小时、95%酒精1小时、无水乙醇1.5小时、无水乙醇1小时、二甲苯一号0.5小时、二甲苯二号0.5小时。

打开包埋机，分别开启冷台，冷点，石蜡槽，组织槽进行工作。然后用铁饭盒承装石蜡块并放入包埋机组织槽中加热溶解。将脱水后的组织连同包埋盒依次放入机器组织槽中，然后再放入石蜡饭盒一号进行第二遍浸蜡，然后石蜡饭盒二号，进行三次浸蜡。

3.选大小符合的模具，先调整机器滴蜡的速度，不宜过快防止有气泡。然后在模具中滴入液体石蜡，然后从饭盒二号中拿出浸后的包埋盒，打开用镊子取出组织放入模具中。然后用包埋盒的另一半盖住模具，再滴入少许石蜡后放到冷台上冷却。按上述步骤继续包埋下一个蜡块。

二．切片、制片

1.打开切片机，固定蜡块（可提前4度冰箱预冷一下），调整刀片和蜡块的距离。然后调整切片厚度，先粗切，看到完整的蜡片并且有组织后切换厚度，调整到自己想要切的厚度。用力均匀，右手摇动切片，左手用毛笔接片。如片子打卷，可以用毛笔按着蜡片的边缘再缓慢切，这样可以得到相对平整的片子。

2.用毛笔和镊子将片子或者带状片子托起，放入水槽中展片，水温在40度左右。然后用防脱片载玻片轻轻捞起，载玻片的边缘尽量不要触碰水槽底部，防止底部气泡上浮残留在片子上。然后标注切片编号放到烤片机上烤片30分钟。

三．组织化学染色

1.室温脱蜡、水化：二甲苯一号10分钟、二甲苯二号8分钟、二甲苯三号8分钟、无水乙醇5分钟、90%乙醇3分钟、80%乙醇3分钟、70%乙醇3分钟。蒸馏水3分钟*3次，PBS3分钟*3次。

2.热抗原修复，换新的切片架，放入水化后的切片。配置抗原修复液（一包柠檬酸钠粉末配置2升PBS溶液），用铁饭盒或者锅加热煮沸。温度控制在96-98度。然后将切片放入热锅中15分钟，最后自然冷却室温。PBS五分钟*2次，蒸馏水3分钟*2次。

3.免疫组化笔画圈：取出组织，甩干水分，可用吸水纸吸干水珠。用组化笔画圈围住组织，圆圈完整。

4.灭活内源酶活性：将切片放入湿盒中，盒中加入少量蒸馏水，滴加3%过氧化氢（二抗试剂盒中A一滴或者50微升，剂量详见二抗说明书），室温孵育10分钟。PBS三分钟*3次，蒸馏水水洗三分钟。

5.封闭非特异性位点：甩干水分，吸干水珠，加山羊血清封闭液（二抗试剂盒B一滴或者50微升），放入湿盒内，室温10分钟。

6.甩掉封闭液，滴加一抗盖住组织，然后放入湿盒内4摄氏度过夜。（一抗浓度见抗体说明书，提前稀释后分装，并在负二十度冰箱保存。每张片子一抗剂量不定，看组织面积大小，xxxxx癌组织一张20微升左右。

7.第二天，4度冰箱取出湿盒，室温复温30分钟，PBS三分钟*三次，蒸馏水洗涤三分钟。

8.甩干水分，吸干水珠，滴加二抗（二抗试剂盒C）一滴或者50微升，室温孵育10分钟。PBS三分钟*三次，蒸馏水水洗三分钟。

9.每张片子滴加一滴或者50微升链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液（二抗试剂盒D），室温孵育10分钟，PBS三分钟*三次，蒸馏水水洗三分钟。

10.每张片子滴加两滴或者100微升DAB溶液，显微镜下观察3-10分钟。染色合适即可终止染色，自来水冲洗。

11.苏木素复染，1-2分钟，细胞核变蓝色即可终止，自来水或者PBS冲洗反蓝（可用0.5%氨水反蓝）。

12.1%盐酸酒精分化3秒，自来水冲洗三分钟。

13.脱水：70%酒精1分钟、80%酒精1分钟、95%酒精2分钟、无水乙醇4分钟、二甲苯一号3分钟、二甲苯二号3分钟。

14.凉干片子后滴加适量中性树胶封片，盖上盖玻片，小心气泡。晾干半天即可。

15.显微镜下拍照。

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