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[交流] 马钱苷元在caco-2细胞模型上的转运特性

分享一篇关于马钱苷转运实验的文献，有兴趣的可以去找找原文。
马钱苷元为环烯醚萜苷类的主要成分，存在于很多药物中，包括山茱萸、续断、翼首草等，具有明显的抗类风湿性关节炎、抗氧化等作用。现有马钱苷元研究多以体外化学和药理学研究为主，未将体内吸收代谢与药效学紧密结合。目前文献报道多集中于定量研究，缺少对其吸收测定的报道。
近年来分子对接技术被广泛应用于潜在中药活性化合物的预测、中药抑制剂的筛选及底物的确定等，具有高效性和一定的准确性。另一方面，P-糖蛋白( P-glycoprotein，P-gp) 是目前研究的主要药物外排蛋白，在口服药物吸收的主要部位胃肠道有高表达，经肠壁细胞吸收的药物可能被此类外排蛋白重新泵出膜外而返回肠腔。维拉帕米是经典的P-gp 转运蛋白抑制剂。故本实验通过分子对接技术，选择维拉帕米抑制剂来考察马钱苷元是否属于P-gp 的底物。Caco-2 细胞是药物吸收研究的快速筛选工具，尤其对于被动转运的药物，与体内吸收具有良好的相关性。此外，Caco-2 模型上能表达各转运蛋白、酶以及受体，广泛应用于药物渗透和转运评价，特异性载体抑制剂或底物的判定等研究。
Caco-2 细胞单层顶侧膜上有较高的P-gp 表达，故本实验选择通过Caco-2 体外模型来研究马钱苷元的吸收转运，并与分子对接技术相结合，考察马钱苷元与P-gp 转运蛋白的结合方式及作用能力。
1、双向转运实验
在Caco-2 细胞单层双向跨膜转运过程中，Papp均呈现明显的浓度依赖性和时间依赖性。随着马钱苷元浓度的升高，其药物累积量增加，Papp值也提高，随时间增加均呈现透过率下降趋势，两侧具有相同的吸收特征。此外Papp( BL→AP) 与Papp( AP→BL) 接近，无显著性差异( P＞0. 05) ，ER 均接近于1，且无明显方向性，提示化合物以被动转运方式进行转运吸收。各浓度马钱苷元在AP→BL 方向的转运量随着时间延长而增加。两部分结果进一步证实马钱苷元的转运方式为被动转运。
2、维拉帕米对马钱苷元转运的影响
维拉帕米抑制剂对马钱苷元AP→BL 方向及BL→AP 方向的渗透率及ER 均无显著性差异( P＞0. 05)，表明马钱苷元在Caco-2细胞单层模型中的转运不存在P-gp 转运蛋白的外排作用。
P-gp 抑制剂具有重要的临床应用价值，P-gp 抑制剂和底物的分类预测研究也是药物研发工作的一个重要内容。P-gp 的主要生理功能是有选择性地外排外源性物质，其在药物的吸收、分布、代谢和排泄等各个环节均发挥着极为重要的作用。本实验通过对马钱苷元与P-gp 蛋白进行对接，发现马钱苷元能与P-gp 通过分子间的氢键、疏水作用等产生结合，而维拉帕米能与P-gp 的多个活性氨基酸位点产生氢键、疏水作用等多个作用力。故维拉帕米对接自由能更高，马钱苷元不能稳定存在于P-gp 中。当维拉帕米与马钱苷元同时使用时，由于马钱苷元与P-gp 结合形成不稳定的复合物，即不是P-gp 的底物，故加入维拉帕米对马钱苷元的转运没有影响，双向Papp无显著差异，ER 值也无影响。
Caco-2 细胞单层模型是最近十几年来国外广泛采用的一种研究药物肠吸收的体外模型，已经成为研究药物摄取、转运等机制的有效工具，其良好的体内外相关性使其成为药物开发早期有效的研究吸收机制的手段。Artursson 等用Caco-2 细胞模型研究了多种不同结构化合物的转运机制，发现Papp值均在5×10－8 ～5×10－5 cm/s 之间，经过与体内研究结果比较发现，吸收率在1% ～ 100%间的物质，其Papp在0. 1～1×10－6 cm/s 之间; 完全吸收物质的Papp一般大于10－4 cm/s，而吸收＜1%的物质，其Papp一般低于10－7 cm/s 。本实验结果显示各浓度马钱苷元Papp值均小于10×10－6 cm/s，故马钱苷元口服吸收较差，生物利用度较低。此外，马钱苷元的吸收转运呈现明显的浓度依赖性和时间依赖性，随着马钱苷元浓度的增加，Papp值也提高，随着转运时间的增加，Papp值减小。理论认为Papp( AP→BL) 与Papp( BL→AP) 接近时，化合物以被动扩散方式转运; 马钱苷元在Caco-2 细胞单层模型的双向跨膜转运过程中，均呈现透过率下降趋势，具有相同的吸收特征，均无明显方向性，双向转运渗透率接近，由该结果可以得出，马钱苷元的转运方式为被动转运。
当Papp( BL→AP) /Papp( AP→BL) ＞ 2 时，化合物可能为P-gp 的底物; Papp( BL→AP) /Papp( AP→BL) ≤1 时，很可能不是P-gp 的底物; 加入维拉帕米抑制剂继续进行考察，发现加入P-gp 抑制剂对各浓度马钱苷元的渗透率即吸收转运没有显著性影响，这与通过分子对接揭示的马钱苷元可能不是P-gp 的底物，不受P-gp介导的多药耐药的调控的结论一致。本实验仅从P-gp 抑制剂的角度表明了P-gp 抑制剂对马钱苷元的跨膜转运没有影响，但是否可以通过其他机制产生影响还需进一步研究。

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