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xuyuzhi

新虫 (正式写手)

[交流] 史上最全点突变实操

https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzU3MzkwMDkzNw==&mid=2247483670&idx=1&sn=0c41f53854060efa0161dca05a6f55bb&chksm=fd3bd0f0ca4c59e6dfec34fe31a776cf775f3959ab29e58ab5b6f503b8bad82d2783d7889e91&token=73890196&lang=zh_CN#rd

也许大概7年前，当导师告诉我要对我所研究的Xxoa蛋白做一些定点突变时，我的内心是拒(bu)绝(gan)的：第一次进行这种大实验，你不能让我做，我就马上开始做。第一我要研究一下原理，方法啊，因为我不愿意什么都不懂就开始一顿忙操作，到头来结果很坏，师兄师姐一定会觉得我很蠢，研究生刚进实验室，第一次还是要给他们眼前一亮的感觉！其次呢，做实验前总要准备试剂，还有各种材料，兵马未动，粮草先行。
于是得先请教一下师兄师姐们：咱们有什么试剂？你们之前是怎么做的？
师姐A:一年多前啦，好像用的是一个试剂盒。
师姐B:这个实验我们也不常做啊，试剂盒内的高保真酶可能用完了。
师兄D：那个Dpn I还有，你再买一管Herculase酶吧
master p：河什么丝，师兄？
师兄D在一张草稿纸上飞速写下“Herculase”,然后说：喏，河口蕾丝，这是比Pfu还牛B的高保真聚合酶，赶紧买一个去吧！
几通电话后，辗转联系到了北京一家公司才算购买到。Agilent是外国大牌，整个天津城都找不到货——还是帝这样的一线大城市好哎。

自那以后，Master P再也没用过那款"河口蕾丝"的酶（主要是没需求，没途径），但是已经在定点突变实验上小有经验。现在就跟随小P来了解一下定点突变的原理与方法吧！
体外诱变有多种方法，这篇主要介绍初学者最容易入门的以环形质粒做模板，并通过Dpn I消化原始模板质粒DNA的方法。
                                                               
原理：
（以下蓝色字体引自《分子克隆实验室指南·第四版》相关章节）
以双链DNA为模板的体外诱变：用Dpn I选择突变体
以变性质粒DNA作为模板，在高保真聚合酶作用下，使用两条寡核苷酸链引导DNA合成。两条寡核苷酸链内均含有预定突变位点，并且两者在质粒DNA上的结合形成彼此反向互补。在该方案中，经过多轮热循环，双链质粒DNA的全长均以线性形式扩增，最终产生一种DNA双链带交错缺口的突变质粒。


图1  环形质粒法定点突变示意图
图片来源于Agilent Quickchange定点突变试剂盒。如图所示，黄绿所示为作为模板的质粒DNA,来源于大肠杆菌；红蓝所示为经过高保真酶扩增而得到的具有nick(缺口，DNA链的磷酸二酯键并未闭合，此类质粒应归类于开放式-环形质粒，拓扑结构与闭合环形质粒有差异。通常，普通教科书内讲述大肠杆菌转化质粒的时候，质粒闭合环形，如从某个菌株提取的质粒，或者经过限制酶切后有经连接酶（T4 DNA ligase 或者Taq DNA ligase）构建而成的质粒。非闭合环形质粒同样也能被大肠杆菌细胞吸收收，断裂的nick可在质粒进入感受态细胞内后被修补。
因为扩增反应使用一定量的模板DNA,野生型质粒DNA的转化子背景将非常高，因此需要增加富集突变体DNA的步骤。该方案通过采用可以特异性消化完全甲基化（5′-Gm6ATC-3′,Vovis and Lacks 1977）的限制酶Dpn I处理线性扩增产物来实现这一目标。Dpn I可以消化扩增反应体系中的来自大肠杆菌的模板DNA,对于扩增产生的DNA则不能消化。未被消化的突变开环质粒DNA可通过转化并筛选带有抗生素抗性的大肠杆菌，最终获得的是还有预突变位点的完整的突变体质粒（在大肠杆菌内复制，提取质粒获得）。根据诱变体的复杂程度和模板长度不同，最终将有15-80%的转化子含有所需要突变的质粒（Weiner,1994）
该方法成功的关键在于引物的设计和选择恰当的热稳定DNA聚合酶，这在该方案的讨论部分会有进一步的论述。
                                                               
实验流程：
将1-10ug质粒DNA溶于40ul H2O中，再加入10 ul 1M NaOH/1mM ETDA溶液。37℃孵育15 min 变性质粒模板。
加入 5 ul 3 M NaAC，pH4.8.再加入150 ul预冷的乙醇沉淀DNA.
4℃ 离心10min 收集变性的质粒DNA。小心弃去乙醇上清。再次乙醇沉淀，之后重新悬浮DNA于 20 ul水中。
配置一下体系
10× Reaction Buffer            5 ul
模板质粒DNA                       5-50ng
Forward Primer(20 mM)       2.5 ul
Reverse Primer (20 mM)      2.5 ul
dNTP                                    2.5 ul
Pfu                                       2.5 U
补水至                                  50 ul
5.    上PCR仪进行反应。单碱基置换：12个循环，一个氨基酸置换：16个循环，插入或者缺失：18个循环。
6.    扩增完成后电泳检测。
7.    直接加入10 U Dpn I到5反应扩增产物内，37℃ 反应1h.
8.    转化大肠杆菌感受态。
9.    挑去数个菌落，培养管培养提取质粒，质粒送一代测序，或者PCR扩增送产物测序。
备注：以上为实验的大致步骤。MasterP根据相关实验内容进行一定幅度的简化描述。但保留必要的步骤，仍可以作为实验参考。
关于1-3步骤：理论上，在质粒DNA 用作PCR模板前不需要变性。如果省略碱变性步骤，超螺旋的天然双链DNA也可以在PCR过程的加热至94℃而变性。
碱变性的好处是：质粒DNA在碱溶液中持续变性后会形成特定的状态，这种形式的质粒DNA可以作为模板，但是没有再次转化细菌的能力。因此，包含非变异的野生型DNA克隆的背景将明显减少（Du et al,1995;Dorrell et al，1996）相对应地，在聚合酶链反应的变性步骤可打乱碱基配对，但并不会破坏质粒分子转化的能力，因此转化后的克隆含有比例较高的非变异的亲本质粒分子。在实验的最后阶段，当需要从克隆中筛选出含有突变的DNA时，碱变性的优势便会体现出来。
如果诱变效率低且所选的Dpn I无效，含有野生型分子的克隆比例可能会异常高。
关于10× Reaction Buffer:因为要扩增一个完整的质粒，长度要比一般的PCR扩增要长，这要求反应缓冲液要适应长片段扩增，pH要高于普通PCR所用Buffer。
关于高保真DNA聚合酶：Pfu的保真度足够，但如今市面上有更好，扩增更快速的高保真DNA聚合酶可用。如果是购买了定点突变试剂盒，使用配套的聚合酶就足够了。
关于PCR循环次数：所有实验尽量不超过20个循环，这是为了保持较低的拷贝数，同时，PCR的后期（20个循环以后的循环内）更容易产生突变，较少的循环数也有利于保真度，出现非预设突变的概率也较低。
关于诱变效率低的实验应用：在步骤7前，需要对扩增产物进行酚氯仿抽提，乙醇沉淀。但是如今一般实验室较少使用酚氯仿这类试剂，实验室使用商品化的PCR产物纯化试剂盒也能完成这一步的产物纯化工作。随后，进行磷酸化，再用连接酶处理。这样的操作是将带nick的开环质粒在分子内而不是分子间环化，更有利于大肠杆菌转化。
关于最终测序验证：测序验证不可少，这一步没必要为节约测序费用而省略。以Master P个人经验，挑去3-5个菌落，培养后提取质粒，测序就足够挑到含目的突变点的突变质粒了。
                                                              
实验材料准备：
一般分子生物学实验室，大多能够完成PCR/电泳/胶回收/转化/细菌培养，所以对常规试剂与仪器将不再列表。
对于有钱的土豪，Master P自然要列出Bigger Than Bigger的试剂,全是大牌进口：如Agilent 公司的Quickchange Site-Directed Mutagenesis Kit,New England Biolabs公司的Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit,ThermoFisher公司的Phusion Site-Directed Mutagenesis Kit或者GeneArt Site-Directed Mutagenesis System等。这些试剂盒无疑都是比较优秀的产品，使用起来方便，所需试剂如dNTP，Dpn I，感受态细胞，甚至SOC培养基都配备齐全。如下图中QuickChange试剂盒的物品清单，便可见Master P所言不假。

图2  QuickChange 突变试剂盒组分清单（取自对应产品说明书）

在此，Master P给出实验所需的高低配置，是不是很像组装电脑配置单？
土豪至尊版配置是这样的：


中产舒适版配置是这样的：


小康宜家版配置是这样的：


温饱挣扎（大神）版配置是这样的：


关于各个版本说明：
Master P发现，任何行业都存在省力气（时间）费钱这么个道理：比如点外卖比自己做饭贵，打车比步行去某地要贵，在网上花钱购买资料贵比辛苦搜寻贵。可见时间就是金钱。人的财富是我们的时间和劳动力，再次印证了亚当斯密诚不欺我也！
使用试剂盒来完成实验固然轻松，但是也有其弊端。在Master P还是学生时期，就不太明白简单如质粒提取试剂盒内各个成分的作用，只知按照说明书无脑一顿操作就能提取到自己想要的质粒。这弱化学习实验原理的动力与机会。
穷人的孩子早当家，没钱的实验室，做实验只能更多的DIY了：试剂都由自己纯手共打造。
那么，为什么定点突变的乞丐（大神）仅仅用一个高保真DNA聚合酶，而不用Dpn I也能完成呢？
原因就在Dpn I只是一个控制原始质粒的手段，而非必不可少。
关键点在控制量：一是使用模板的量，虽然5ng的质粒DNA是一个理想的模板浓度，但是低至0.1ng的模板DNA也是可以扩增出来的；这就弱化了Dpn I消化的必要性。二是可以牺牲一点点保真度的考量，增加几个循环以使扩增产物相对模板量比例更高一点。三是可以挑取5个转化子，按照概率算，只要前两步关键点控制好，肯定得到至少一个正确突变点。这就足够了，谁让我们穷呐！
当然，如果不嫌麻烦，提前对模板做个碱变性，也是能提高效率，降低背景的。
                                                               
引物设计原则
一对寡核苷酸引物：
必须能与同一目标序列互补
长度必须相等（在25-45个碱基之间）；计算出的解链温度为78℃或更高。Tm应足够高以防止错配，并且足够低以便允许引物-引物二聚体在扩增反应的变性步骤解开。
应终止在一个G或者C残基
不需要磷酸化。
通常未经纯化便可使用。然而，如果使用快速液相色谱（FPLC）或聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化获得引物进行突变，尤其是产生插入和缺失突变时，效率会更高。
当引入点突变时，一个引物带有野生型序列，而另一条引物含有所需的突变，并且在突变位置的两侧都至少含有12个碱基的正确序列。如果产生缺失突变，两个引物都含有野生型序列，但它们的间距在模板上的距离与缺失片段的长度相关。产生插入突变的话，需要一个引物包含的野生型序列而另一个引物的5`端含有需要插入片段的序列。
这段关于分子克隆四版关于引物设计的原封抄写，个人感觉有一半含混不清。不知道美国作者的错，还是军科院研究生翻译水平的偏差？话说整体来看，第四版中文版错误的地方还真不少，很多翻译的原因，难道真如Master P的导师所针砭的，90年代的研究生，00年代的研究生和10年代的研究生，一代不如一代？

不能太教条，尽信书不如无书，即使是分子生物学中的Bible级别的工具书。事实上，任何人也都不可能在所有方面成为专家。且不说一代不如一代这样的问题，现在读研的学生越来越多，大有“人均研究生”的趋势，那么治学严谨的研究生所占比例，究竟是低了？
即便是Agilent公司，也没有彻底修改自己的引物设计原则。Lei Zheng等（2004）报道了一种部分重叠的突变引物设计原则，效果不错。QuickChange有一版说明书引用了这篇，但是仍没有作为主流方法。


图3 Partial Overlapping 引物设计方法示意图
与标准QuickChange 设计方法相比，两对引物非完全互补的Partial Overlapping设计方法有以下几个好处：
Tm不再是不得不考虑的因素，更广泛的碱基序列可被用到序列设计区域
可以跨越更宽的序列区域。
突变位点可离5`端4bp，离3`端6-8bp,而标准QC设计是要放在离两端10-15bp的中间。
一条引物可包含更多突变碱基，最高达17.5%的突变碱基占比，这一特点对需要考虑中性突变的应用更加有用。
Overlapping设计的一些原则：
3`端非重叠区域包含至少8bp
目标突变点序列应包含在上下游序列内，中性突变应至少包含在一条引物内。
引物末端至少1个G或者C碱基。
也许，从善如流真的很难做到。有需求的可以下载此篇看看，NAR的文章基本都是免费的。

图4     Lei Zheng关于定点突变的文献
                                                                 
聚合酶酶选择：
应满足三个基本需求：1.校对活性高；2.碱基错配率低；3.缺乏非模板末端转移酶活性
MasterP发现，中文的《分子克隆实验室指南》确实不能深究，以上3个特点让人迷惑，校对活性是保真度所依赖的活性，而保真度高自然错配率低，所以1和2严格来说就是一个特点呀！第三点就是不依赖模板的末端转移酶（Terminal transferase，TdT）活性，翻译为“非模板末端转移酶活性”是不妥的，这个研究生应该出来挨打。当然还有别的例子，翻译人员理解程度，或者严谨性决定了翻译质量。
MasterP一言以蔽之：不要用Taq DNA聚合酶，选一个能扩增长片段的高保真DNA聚合酶就完事了！
                                                               
引物设计实例：
需要定点突变的实验，大多数是氨基酸定点突变，还有一些是基因调控序列（UP element,启动子序列，或者转录起始区域）的突变研究。
尽管生物学发展到9102年了，但是蛋白质单点氨基酸突变还是研究某个点对蛋白质整体折叠与稳定性或活性关键位点的有用方法，即使知道了野生型酶的三维结构，仍无法准确回答某位点的改变对酶整体的影响变化。
一个突出的典型的例子是Tabor和Richardson（1990）对T7 DNA聚合酶活性位点的研究，这一成果带来了用于热循环测序所用的Taq DNA聚合酶开发。
下面Master P将列出两张图以揭示两种不同引物设计的直观差别

图5 经典的QuickChange定点突变引物设计

图6 Overlapping定点突变引物设计
个人倾向于第二种设计方式，因为上下游引物不会完全互补，退火受到影响更小，如果感兴趣可以结合引物设计的基本理论在脑海里模拟这个退火延伸的过程。
                                                                 
以上是关于以环形质粒做定点突变方法的主要内容。希望能给初学者带来指导性的方法，也希望能为行业老兵带来新的思考角度。可惜个人订阅号关注者还太少，离可开通评论功能还差的有点远。Master P还会努力的。
2019-4-29
                                                               
利益冲突声明
Master P就职于北京某生物科技公司研发岗。本文涉及的产品及相关评价均来自参考资料或本人实际经验总结，如涉及侵权请联系删除，本人不对以上所有产品或服务作任何目的性、倾向性引导，因此，Master P不对以上产品或服务的实际使用效果承担任何责任！
2019-4-29
                                                                 
参考文献
1.M.R.格林，J.萨姆布鲁克.体外诱变方法，《分子克隆实验室指南》第四版中文版，2017，科学出版社
2.Vovis GF，et al.Complementary action fo restriction enzymes endo R-Dpn I and R-DpnII on bacteriophage f1 DNA.J Mol Biol 115:525-538
3.Weiner,M P，et al.Site-directed mutagenesis of double-stranded DNA by thepolymerase chain reaction.Gene 151:119-123
4.Du Z，et al.Improved recombinant PCR mutagenesis procedure that usesalkaline-denatured plasmid template.Biotechniques 18:376-378
5.Dorrell N,et al.Improved efficiency of inverse PCRmutagenesis.Biotechniques 21：604-608
6. QuikChangeII Site-Directed Mutagenesis Kit Instruction manual,Version E.0，Agilent
7.Lei Z,et al. An efficient one-step site-directed and site-saturation mutagenesisprotocol.Nucleic Acid Research,2004,32:e115

https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzU3MzkwMDkzNw==&mid=2247483670&idx=1&sn=0c41f53854060efa0161dca05a6f55bb&chksm=fd3bd0f0ca4c59e6dfec34fe31a776cf775f3959ab29e58ab5b6f503b8bad82d2783d7889e91&token=73890196&lang=zh_CN#rd
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1楼2019-05-20 21:57:13
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ouyang1999

新虫 (初入文坛)
★
xuyuzhi(金币+1): 谢谢参与
我对于这种方法的原理还有些疑问，我按照您所述的引物设计画了一张图，发现好像这样画，得不到图中所述的带有交错缺口的突变质粒。在第一个循环新合成的那条链会有个缺口，也就是新合成的是一个线性化的链，我不太明白在PCR的第二个循环，第一个循环新合成的那条链有个缺口的话，那下游引物在退火时和它互补之后，还能够继续延伸最后合成完整的链吗？如果把线性化的链看成是普通PCR一样的长链，那么好像就得不到这个视频里所说的带有交错缺口的突变质粒哎
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22楼2020-11-29 15:42:24
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ZzzOoodddd5楼
2019-05-21 00:37   回复  
xuyuzhi(金币+1): 谢谢参与
祝福 发自小木虫IOS客户端
Qifang_qi7楼
2019-05-21 08:49   回复  
xuyuzhi(金币+1): 谢谢参与
祝福 发自小木虫IOS客户端
撸铁撸科研8楼
2019-05-21 08:56   回复  
xuyuzhi(金币+1): 谢谢参与
， 发自小木虫IOS客户端
撸铁撸科研13楼
2019-05-24 11:31   回复  
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