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Western blotting之样品制备
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无论你是处理细胞还是组织样本，蛋白提取都是一个很艰难的过程。要么使用物理方法将细胞破碎或者使用化学试剂处理细胞进行裂解。如果第一步提取就搞砸的话，那么长时间小心翼翼培养的细胞就会完全浪费。这里有一些建议可以帮助你进行样品的抽提。 头号公敌：蛋白酶 无论您选择哪种提取方法，蛋白酶都将是一个主要的关注点。当你需要的时候，蛋白酶是很有用的，但是如果你不需要，它们会在短时间内降解目标蛋白。在细胞被胰蛋白酶消化后，在裂解前彻底清洗去除所有的胰蛋白酶。同样的道理也适用于组织，在溶解前要彻底清洗，以清除残留的血液，其中也含有蛋白酶。清洗之后细胞是干净的，准备裂解，要添加蛋白酶抑制剂到裂解缓冲液中。使用蛋白酶抑制剂，并保持样本在冰上，以防止蛋白降解。如果研究的是磷酸化蛋白，也可以添加磷酸酶抑制剂。 物理vs.化学方法破碎细胞 物理裂解方法包括超声、均质、反复冻融和机械破碎(研磨、切碎和碾压)。当不想把化学和酶引入到提取系统中，物理裂解是理想的。然而，专业设备的要求往往会使过程不一致，难以扩大规模，成本过高。由于物理方法有关的压力和温度很高，因此还必须小心避免蛋白变性和聚集。在整个过程中，把所有的东西都预先冷却，并保持样品的低温状态。 如果您无法使用物理方法裂解细胞，请不要担心。有很多抽提试剂可以帮助提取蛋白。试剂裂解法因其操作简便、蛋白提取量高、稳定性好、价格低廉等优点而日益受到人们的欢迎。试剂裂解法的主要缺点是一些盐和去垢剂等干扰下游分析。如果进行蛋白功能研究，在选择缓冲液和去垢剂时需要谨慎。 去垢剂的选择 如果抽提的样品量大，添加SDS和其他离子去垢剂到你的缓冲液将是你最好的选择。对于Western blotting，使用含有SDS的缓冲液是理想的，例如1X RIPA，因为它在溶解细胞蛋白方面非常有效。如果蛋白需要在其天然构象中正常发挥作用，最好使用温和的提取方法，使用非离子去垢剂，如NP-40或Triton X-100。 浓度测定：最后，使用Bradford、BCA或Lowry进行蛋白的测定，进行蛋白的等量上样。 |
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2019-05-07 10:57:14, 172.43 K
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