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蛇床子素及其制剂在Caco-2 细胞模型中转运机制的研究
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分享一篇关于植物提取物进行药物吸收渗透方面的实验,篇幅较长，为方便大家学习，我进行了删减。 目的： 研究蛇床子素及其制剂在Caco-2 细胞模型中的摄取、转运机制。方法：建立Caco-2 细胞单层模型，研究蛇床子素、蛇床子素β-环糊精包合物及其包合物分散片的摄取和跨膜转运，考察其时间、温度、浓度、吸收促进剂和抑制剂对药物摄取及跨膜吸收的影响，并比较原料药与制剂吸收过程的差异。结果：Caco-2 细胞对蛇床子素及其制剂溶液的摄取与时间、温度、浓度均呈正相关，p-糖蛋白抑制剂（CyA）与能量抑制剂（NaN3）对摄取无显著性影响，其摄取量的大小依次为分散片＞包合物＞原料药；转运实验中，随浓度和温度的增加，蛇床子素及其制剂的溶液在Caco-2 细胞中的转运量均增加，而PAP 与PBL 比值无明显变化，p-糖蛋白抑制剂（CyA）、能量抑制剂（NaN3）、细胞内吞抑制剂-氧化苯砷(oxophenylarsine)及细胞旁路转运促进剂-去氧胆酸钠(sodium deoxycholate，SDCh)对蛇床子素的转运无影响，而去氧胆酸钠对包合物和分散片的转运有明显的影响，3 种制剂AP-BL 方向上的Papp为分散片＞包合物＞原料药。结论：蛇床子素主要以被动扩散的方式被吸收，包合物和分散片中的药物以被动转运为主，少部分以细胞旁路转运途径被细胞吸收；难溶性药物经包合物可促进其吸收，制剂辅料对药物的吸收有一定的促进作用。 1. Caco-2 细胞培养 用DMEM 培养液(高糖)，包括10% 胎牛血清、1% 非必需氨基酸、1% L-谷氨酰胺和1% 青-链霉素。将Caco-2 细胞移入卡氏培养瓶中，并置于37 ℃ 培养箱中，通入5% CO2 培养。 2.蛇床子素储备液的制备 精密称取蛇床子素对照品10.0 mg 于10 mL 量瓶中，用乙醇定容，摇匀，制成1.0 mg/mL 的储备液。 3. 蛇床子素供试液的制备 精密量取适量蛇床子素储备夜，用PBS 溶液配制成质量浓度分别为10，50，100，200，500 μg/mL供试液（DMSO助溶，含量<0.1%），并制备相应药物浓度下的蛇床子素制剂的供试液，过滤除菌，用于MTT 实验。 4. MTT 法细胞毒性的评价 细胞毒性的测定采用噻唑蓝MTT 比色法(MTTassay)。收集对数生长期Caco-2 细胞，按每孔10000 个细胞接种于96 孔板中，边缘孔用PBS填充，孵育12~24 h，至细胞单层铺满孔底，吸弃培养液，按一定顺序分别向每孔中加入“2.5”项下的Ost 储备液各100 μL，每个浓度设5个复孔，不含药物的孔作为阴性对照，培养液作调零孔。将其培养36~48 h 后，每孔加入5 mg/mL MTT 溶液20 μL，继续孵育4~6 h，终止培养，小心吸去上层液体，用PBS 溶液冲洗3 次。每孔中加入DMSO 100 μL，置摇床低速振荡15 min，置酶联免疫检测仪，在630 nm 波长处测各孔的吸光值，确定药物对Caco-2 细胞的安全浓度范围。 5. Caco-2 细胞摄取的实验 取Caco-2 细胞于6 孔板中培养，每孔1.0×104个细胞，置37 ℃，5%CO2 培养箱中培养15 d。试验前用空白pH 7.4 PBS等渗溶液，置37 ℃ 培养20 min，吸去缓冲溶液。用空白缓冲溶液轻轻清洗2 次，洗去细胞单分子层表面的杂质。加入“2.5”蛇床子素供试品溶液的制备项下蛇床子素及2 种制剂溶液各2 mL，分别考察药物浓度（20，60，100 μg/L）、时间（5，15，30 min）、温度(4，25，37 ℃)、p-糖蛋白抑制剂CyA(50 μmol/L)、能量抑制剂NaN3(25mmol/L)对细胞摄取的影响。实验结束后，加入空白PBS 溶液终止细胞摄取试验，并将细胞单分子层快速清洗2 次，加入2 mL 空白PBS 液，用细胞刮取器将细胞刮入Ep 管中，超声粉碎细胞，一部分按“细胞样品的处理”项下方法操作后，测定药物浓度；一部分用考马思亮蓝法测定细胞蛋白含量[14]，求算细胞的摄取量ω(μg/mg），求得ω(μg/mg）＝COst/CProtein。 注：式中COst 为细胞中Ost 的质量浓度（μg/mL）；CProtein为细胞悬液中细胞蛋白的质量浓度（mg/mL)。 6. Caco-2 细胞转运的实验 用培养21 d，符合摄取条件，其细胞生长形态完好的Millicell 膜，试验前用空白pH 7.4 PBS 等渗溶液，置37 ℃ 下培养20 min，清洗2 次，洗去细胞单分子层表面的杂质。考察AP 侧BL 侧的转运，在AP 侧加入药物溶液0.5 mL 作为供给液，在BL 侧加入1.5mL 空白PBS 液作为接收液。对于从BL 侧到AP 侧转运：将1.5 mL 药物溶液加到BL 侧作为供给液，0.5 mL 空白pH7.4 PBS 液加到AP 侧作为接收液；待分别在5，15，30，60，120 min 时吸取100 μL 接收液，测定药物浓度，计算表观透过系数（Papp)，求得Papp＝1.0×10－6 cm/s；同时补加等量37 ℃ 空白PBS液以及考察浓度（20，60，100 μg/mL）、温度（4，25，37 ℃）、p-糖蛋白抑制剂（CyA，50μmol/L)、能量抑制剂（NaN3）(25 mmol/L)、细胞内吞抑制剂-氧化苯砷(oxophenylarsine)(25 mmol/L)及细胞旁路转运促进剂- 去氧胆酸钠(sodium deoxycholate，SDCh)（100mmol/L）对药物转运的影响。按下列公式计算：表观透过系数Papp＝(dQ/dt)/(A×C0)。 注：式中dQ/dt 为接受端受试药物出现的速率(μg/min)；A 指聚碳酯膜表面积(≈1.1cm2)，C0是药物在供体室的初始浓度）表观渗透率PDR＝Papp(B → A)/Papp(A → B)注：Papp(B→ A)为基底侧BL到肠腔侧AP的表观透过系数；Papp(A→ B)为肠腔侧AP到基底侧BL的表观透过系数。 详细信息可以查看原文献哈《蛇床子素及其制剂在Caco-2 细胞模型中转运机制的研究》。 |
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