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wanedel

[交流] 求助pgl3的连接问题

做了好久的连接都没有成功,希望大家能帮帮我 非常感谢!
我是自己退火形成的一百多bp的一段目的基因  Kpn1 和Nhe1双酶切这个基因和载体Pgl3后 分别跑胶回收再连接 转化
问题是阳性菌落挑出来培养后抽提 酶切鉴定没有出现一百多的片段 只有5K到6k的两条片段  我甚至拿去测序了 用RVprimer3测到片段居然是pgl3 1000位点的一段了
这是出什么问题了呢?
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elvias

铁杆木虫 (正式写手)

有可能使退火没有弄好,没有形成双链结构。
同时,你退火的基因酶切后就不要跑胶回收了,100bp回收率很低,也可能是造成没有连接上的原因,直接热失活内切酶就可以了。
还有pgl3酶切不太可能出现5K到6k的两条片段,pgl3只有4800左右,你也应该看看你有的是不是空的pgl3,又没有连接其它启动子
2楼2009-05-18 21:04:50
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wanedel

退火好像没问题的 跑胶浓度貌似还很大的样子
我也觉得酶切之后跑胶回收有损失了 现在在试不跑胶就回收了
会是PGL3出问题了吗?
继续请教-------
3楼2009-05-21 21:15:47
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elvias

铁杆木虫 (正式写手)

你应该看看你有的是不是空的pgl3载体,有没有连接其它启动子,这是有可能出的问题
4楼2009-05-21 22:34:48
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wanedel

怎么看有没有连接其他启动子呢?这个好深奥啊!
5楼2009-05-26 09:58:43
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