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bclz

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 试验新手弱弱的问

最近刚开始做实验,由于某种原因,愣是把一个200bp左右的基因合成了上下互补的四个片段,如图示,最小的片段是30碱基,其他的三条互补的碱基都是25个。我们先分别磷酸化,然后混合四个片段用pfu补平,再用上下游引物pcr,总是不出来条带,急问大家,这样思路对吗?还是中间要注意些什么啊?谢谢大家了,图示见下面的四条曲线所示

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[ Last edited by 350784478 on 2009-10-1 at 13:10 ]
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★
bclz(金币+1,VIP+0): 5-18 16:23
sutao1979(金币+1,VIP+0):谢谢参与 5-18 20:10
合成的长片段应该经95℃左右充分变性,然后逐渐降低温度,慢慢退火,否则很容易形成单链的二级结构,做不出来
这么做还是可以做的
2楼2009-05-18 15:39:24
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

另外,你的碱基数描述……有错误?
3楼2009-05-18 15:40:07
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bclz

铁杆木虫 (正式写手)

一共好像是217bp,三个长片段均为89个碱基,前面的短的是三十个碱基,两边互补的均为25个碱基

我就是害怕它能不能配上对,然后pfu可以把它补平啊?
4楼2009-05-18 16:04:00
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bclz

铁杆木虫 (正式写手)

对了,我把每个片段都磷酸化,然后让它补平,最后用t4连接酶连可以吗?
5楼2009-05-18 16:06:16
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