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阳光雨露118

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[求助] 做定点突变时连个基因片段融合不了！！！已有1人参与

各位大神：
你们好，我最近在做定点突变，突变位点在基因的中部，做pcr时先p出前部分基因片段和后部分片段，然后利用PCR将前部分和后部分基因片段做模板，加入上下游物做融合PCR,融合时依据引物Tm值将退火温度设置为71.5度，但总失败，求原因！求指导！！！！

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1楼 2019-04-15 17:15:29

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蓝韵pretty

新虫 (初入文坛)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
阳光雨露118: 金币+20, ★★★很有帮助 2019-04-22 15:15:57

你是做重叠延伸PCR吧？前后片段做胶回收了吗？重叠了多少个碱基呢？退火温度太高了吧？你可以设置一个梯度看看。回收回来的前后片段你可以放在一起延伸之后再以此作为模板，用两端的上下游引物进行扩增。

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阳光雨露118

2楼2019-04-17 08:48:39

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阳光雨露118

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引用回帖:

2楼: Originally posted by 蓝韵pretty at 2019-04-17 08:48:39
你是做重叠延伸PCR吧？前后片段做胶回收了吗？重叠了多少个碱基呢？退火温度太高了吧？你可以设置一个梯度看看。回收回来的前后片段你可以放在一起延伸之后再以此作为模板，用两端的上下游引物进行扩增。

谢谢

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3楼2019-05-15 10:50:36

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