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氨氧化古菌（AOA）克隆测序问题求助！！！！！！
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我做的是土壤中氨氧化细菌（AOB）和古菌（AOA）对环境变化的响应情况研究 采用的克隆/DGGE的办法检验AOA和AOB的种群结构的变化。AOA的引物有两对，第一对用于克隆测序，并且其产物用第二对引物pcr之后上DGGE.第一步目前遇到超级大麻烦。从来没有遇到过。第一对引物为：A109f/1492r (Grosskopf et al. 1998; Graeme Nicol modified) 1492r-GN GYYACCTTGTTACGACTT A109f ACKGCTCAGTAACACGT 第二对引物为：Cren771/957r + GC (Ochsenreiter et al., 2003) - anneal 55oC Cren16S957r-GC CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCGGCGTTGACTCCAATTG Cren16S771f ACGGTGAGGGATGAAAGCT 做克隆的载体是promega的T-easy,具体问题如下： 做完克隆我用T7,sp6检验过确实有插入片段，然后去测序，结果测了48个样品，才有两个是AOA(NCBI BLAST),以为是我提质粒的问题，所以重新摇菌提质粒，这次用第一对引物PCR,然后用第二对引物确认之后再去测序，而且跑胶检验条带很亮的才去测序，结果还是只有一个是AOA. 因为我这是在国外做实验，测序时，我不但要提质粒，还要准备好测序的产物，即用bigDye做PCR反应。不知道会不会是这个过程中会有污染。 还有就是测序报告说信号很弱，可能是我反应体系加的bigDye比较少吧，不过每管也有1ul-1.5ul，应该不少了，国内很多人做还有更低的。 谁能救我啊！！！时间和金钱浪费太多了！！！ 同样条件，我做AOB测序的结果就相对好很多。大多数测序结果都对。 谁人能帮解决这个问题，我可以帮你下资料，呵呵！！！ |
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4楼2009-05-20 11:10:43
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当然是纯化回收的，我大概也知道可能是第一步PCR退火温度太低了，47度，因为如果不低的话很难获得PCR产物。另外1492r这个引物是可以细菌通用的，所以可P出细菌来。但是确实很奇怪，第二套引物只是对古菌特异的，但是能P出来的，竟然测序测不出来，见鬼！后来我又检验了，用A109f和Cren957r这对引物检验，当然是古菌的一定会有，但是为什么我做细菌的PCR比如说AOB竟然也有很弱的条带，位置一样。这样我做了阳性和阴性对照，阳性时原来测序是对的，阴性是AOB克隆质粒，一个通用引物P的细菌克隆和没有加样品的空白反应体系。目的片段应该是840bp,结果是空白没有任何条带，AOB在大约1500bp处有弱条带，通用引物p的细菌克隆在840bp和1500bp均有弱条带，AOA克隆子，有的在840bp有弱条带，有的非常亮。但是奇怪的是，我测序的结果表明就是亮的也不是AOA.因为在测序结果里根本找不到对应的序列，糊涂了。污染的可能性是可以排除的，另外如果是测序的问题我觉得也不可能，因为我检查了一个克隆子，我送去测过两次，序列是一样的。 看来是什么，什么在考验我似的 |
5楼2009-05-23 13:55:52
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