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zlwcw

木虫 (著名写手)

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专业: 代谢性疾病药物药理

[交流] 默克公司的蛋白表达纯化手册（pET 系统）

感觉好的，给个奖赏呀~~~

内容提要
I.  系统介绍
概况
A.
B.  使用许可及协议
C.  系统组成
D.  选择合适的 pET 载体
基本考虑因素
蛋白溶解性及细胞定位
融合标签
各种pET 载体特性列表
E.  pET 载体克隆策略
制备不带融合标签的天然蛋白
制备以蛋白酶切去融合标签的
不需连接反应的克隆方法(LIC
F.  pET 系统蛋白表达的调控
T7lac启动子
pLysS和 pLysE宿主菌
载体与宿主菌共同影响表达水
含葡萄糖的培养基
pLacI宿主菌
pETcoco?系统
G.  用于克隆的宿主菌
H.  用于表达的宿主菌
蛋白酶缺陷型
调节培养体系中所有细胞的表
二硫键的形成及增加蛋白可溶
补充稀有密码子
硒代甲硫氨酸标记
pET系统各种宿主菌特性列表
I.  抗生素抗性
J.  CE6噬菌体
K.  诱导对照
II.  建立原核表达体系的基本知识
A.  pET 系统操作流程
B.  生长培养基
C.  菌株保存
D.  制备载体
E.  制备插入片段
III. 目的片段克隆
连接反应
A.
B.  转化
操作小诀窍
操作步骤
铺板技术
C.  pET重组子分析
用EcoPro? 系统分析转录/翻译水平
质粒模板
PCR模板
转录/翻译分析的连接 PCR
转录/翻译分析的菌落PCR
菌落筛选
质粒制备
测序
达目的基因
A.  转化表达用宿主菌株
B.  DE3溶原菌的诱导
诱导的准备工作
诱导的操作步骤
化表达条件
增加蛋白溶解性及折叠
A.
温度
裂解缓冲液
细胞周质定位
细胞质定位
宿主菌
B.  稀有密码子
C.  毒性基因及质粒不稳定性
氨苄青霉素的使用
补充葡萄糖
质粒稳定性测试
稳定甘油菌株保存过程中氨苄抗性 pET载体上的毒性基因的措施
稳定诱导过程中氨苄抗性 pET 载体上的毒性基因的措施
D.  影响表达的其它因素
N-端原则
二级翻译起始位点
mRNA转录产物中的二级结构
意外终止密码子

转录终止子
不稳定的目的mRNA及蛋白
的蛋白分析
SDS-PAGE电泳上样体积标准化
生长和诱导
诱导培养物的光密度分析
A.  用 PopCulture? 快速分析蛋白表达水平、活性及可溶性
B.  细胞总蛋白组分
C.  培养基组分
D.  细胞周质组分
细胞质可溶部分组分
E.
? ?
BugBuster  和Benzonase  核酸酶处理
rLysozyme? 溶液和冻融处理
机械破碎
F.  细胞质不溶部分组分
?
BugBuster 试剂处理后的包涵体纯化
机械性裂解细胞的包涵体纯化
G.  用 PopCulture? 试剂制备抽提物
VII. 目的蛋白的鉴定和定量
A.  标准 SDS-PAGE凝胶电泳上样
B.  融合标签的检测/分析工具
VIII.目的蛋白的纯化
纯化工具
A.
B.  溶解与重折叠
IX.  诱导对照：β－半乳糖苷酶重组物
?β－半乳糖苷酶分析
X. pET系统宿主菌以及 λ噬菌体
用于蛋白表达的lDE3溶原菌
用于初始克隆、对照和表达的同基因宿主菌
系统宿主菌感受态细胞套装产品
pET
pET系统的?噬菌体
XI. 附录：基因蛋白功能研究产品
基因突变产品大全
蛋白质相互作用双杂交系统
T7噬菌体展示系统
基因沉默研究产品

[ Last edited by zlwcw on 2009-5-17 at 11:44 ]

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