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菌液PCR验证有目的条带，摇单菌落却摇不起来，求指点！
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| 目的片段酶切以后和酶切过的Pet30a载体连接，37℃培养12h左右板子上就长满了密密麻麻的单菌落（个头比较小），不敢继续长怕连在一起就拿出来放冰箱了。看着感觉不太对但是我还是挑取了4个做菌液PCR验证，其中有1个有目的条带，另外3个条带看不太出来但是我觉得也有（怀疑是不是因为个头太小我没挑到）。但是有目的条带的那1个单菌落摇菌到现在（三十几个小时过去了）培养基还是澄清的，不知道是哪一步出了问题，求大神指点！之前也做过一次连接30a的，板子也出现一样的情况，当时以为是自己载体没处理好，这次换用师姐确定是做的出来的pet30a还是这样子。 |
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2楼2019-03-28 15:29:17
hanxiaominhu
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2019-04-30 23:37:30
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2019-04-30 23:37:30
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是大肠杆菌吧，这样摇30多个小时即使出来也不能用。唯一P出来的可能是假阳性吧。你要注意的是板子的抗生素有没有失效，看看不转化直接涂板子是不是也长小菌落。 发自小木虫Android客户端 |
3楼2019-03-28 20:47:23
4楼2019-04-01 11:00:27
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是的，是大肠杆菌。抗生素用的对的呢，同一批倒的板子和pet28a连接的连接产物电转长出来的单菌落个数和大小都挺正常的，菌落pcr验证也都对的，菌液也摇浓提出质粒了。但是30a的我昨天又做了一次，这次涂布了三分之一，但是板子上长出的情况和第一次还是相同，还是觉得很奇怪 发自小木虫IOS客户端 |
5楼2019-04-01 11:01:43
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在实验过程中我还遇到一个问题。就是连接pet28a载体的时候任意挑取6个单菌落摇菌，菌液pcr验证出有阳性条带，也提出质粒，但是双酶切切不开，送测序发现连接处的一个酶切位点被破坏了。一开始怀疑是不是我载体的问题，用了师姐酶切正确她实验做出来的载体还是出现一样的结果。又怀疑是不是pcr出现了突变，我又重p了一次，然后结果还是一样，还是这个酶切位点被破坏了。有人遇到过这种情况吗？ 发自小木虫IOS客户端 |
6楼2019-04-01 11:06:53
7楼2019-04-15 22:38:11
 本帖仅楼主可见 |
8楼2019-04-30 09:59:59
