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蛋白不挂镍柱，关于变性上柱的问题 已有1人参与
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蛋白n端有6histag + mbp, 现在用镍柱纯化，发现蛋白几乎全在flow through里。（大家可能要问我为什么不用amylose resin既然有mbp的话。我的蛋白是个膜蛋白，虽然mbp提高了溶解性，目前还加着去垢剂，无法确定去垢剂是否会影响amylose binding。并且用该柱纯化后需要透析，在这过程中会透析掉去垢剂，不确定这样蛋白会不会沉淀。）所以目前是先计划变性后再上镍柱，这个蛋白里cystein相当多，也就是说二硫键多，当然也会形成多聚体，我的问题是在变性上柱的buffer里加了8m尿素，还要不要加个5mm 巯基乙醇（这点是否够）？查看了别人的做法是上柱前加巯基乙醇，洗柱子的buffer里不加，最后洗脱液里再加巯基乙醇，不知道这最后一步是不是为了蛋白在被洗脱下来的过程中不形成多聚体？我是希望在柱上复性的，所以洗脱液里不打算加尿素。不知道洗脱液里能不能不加巯基乙醇？不加会怎样？请大家给点建议！多谢了！ (质粒测序正确，表达后跑过sdspage已看到表达的蛋白条带。没加目标蛋白前，空载体能表达6histag-MBP, 并且能在镍柱上纯化出来MBP。为什么在它C端加了目标蛋白后就挂不上柱子了呢？是因为目标蛋白使得形成了多聚体或包涵体吗？) |
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可能是蛋白形成聚集体造成空间位阻，可尝试XL系列有延伸臂或者专门做大分子的填料。因为是膜蛋白，可能是因为疏水作用较强，形成了胶束，我之前做的一个膜蛋白，是在蛋白液里面加终浓度0.5%的SDS才能挂柱的，你可以尝试一下，不过要考虑去垢剂的去除问题，祝你早日成功！ 发自小木虫Android客户端 |
5楼2019-05-11 20:22:53
panbenxun
木虫 (小有名气)
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2楼2019-03-22 18:50:27
3楼2019-03-23 09:48:19
4楼2019-04-11 15:19:47
