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luneworchid新虫 (初入文坛)
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[交流]
煮沸法提取血清HBV DNA相关问题求解，谢谢
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我是从一篇博士学位论文《提高乙型肝炎病毒p基因区PCR检测阳性率的策略及阿德福韦醋治疗中HBV基因型耐药临床监测研究》看到，用煮沸法提取血清中HBV DNA：直接沸水浴５ｍｉｎ，然后１５０００ｒｐｍ离心５ｍｉｎ，吸上清４ｕｌ作为PCR模板。这篇文献中所提取的HBV DNA的ＯＤ２６０／２８０都是１.８几，浓度大概是５０多（ｕｇ／ｍｌ），他把几种方法做了对比发现，这种煮沸法提取的DNA最多。 我的操作过程是这样的，大约７００ｕｌ血清（HBV-DNA: 7.72×106ｃｏｐｉｅｓ），煮沸了５ｍｉｎ，我觉得太烫了，就在－２０℃放了５ｍｉｎ左右，由于我当时没能换算×ｇ和rpm，所以直接用了１５０００×ｇ离心了５分钟，然后把上清液吸出来保存在－２０℃。 今天测了ＯＤ２６０／２８０只有０.５７，浓度是１０５.９ｎｇ／ｕｌ。上面 请问各位前辈，我的问题出现在哪里？是不是我不该在煮沸后放入－２０℃？是不是我的血清太多了？是不是我的离心速度太大（是不是离心速度过大把蛋白混入了上清液）？ 请各位前辈指点，这样的DNA能否作为明天PCR的模板？如果可以，在２５ｕｌ和１０ｕｌ体系应该分别加多少ｕｌ？ 另外，各种离心速度离心血清时，分别沉淀什么？ 谢谢！非常感谢！！ [ Last edited by 350784478 on 2009-9-19 at 13:04 ] |
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