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电转染实验影响因素 已有1人参与
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1 电场参数 电场是电转染的重要因素，细胞在电场的作用下，膜通透性增加或是形成小孔，以完成转染过程。因此电场强度是应该被优化的主要参数。电场强度不能过高，过高会增加细胞的死亡率；也不能过低，过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。因此，一个适宜的电场强度至关重要。 不同细胞系具有不同的最佳场强值，其确定方法除了实验直接测定比较不同场强下转染率的高低外，还可以采取较为简便的间接法。文献显示存活率在50%左右的电场参数为理想参数，故可间接测定存活率来确定最佳场强值。 2脉冲过程 1）脉冲波形 脉冲波形主要分为两种：1、方波脉冲；2、指数递减波脉冲。 方波脉冲是指：电压瞬间升至预设电压，保持电压放电，然后瞬间终止放电。 一般哺乳动物细胞电转染时选择方波脉冲，有较高的转染效率和细胞存活率。 指数递减波脉冲是指：先对电容充电，然后让电容完全放电，其电压变化呈指数递减。一般这种波形的脉冲电转染适用于细菌、酵母菌、昆虫细胞。 2）脉冲时间 脉冲时间的选定主要取决与脉冲波形。在方波脉冲中，脉冲时间可直接设定。在指数递减波脉冲中，脉冲时间是指电压衰减至初始电压1/3时所用的时间，等于电容（C）与电阻（R）的乘积，单位是ms。在参数优化中，增加电压应当降低脉冲时间，而减小电压则应当增大脉冲时间。 3）脉冲次数 一般而言，对于大多数细胞类型都选择单次脉冲。而在有些情况下可能会用到多次脉冲，因为低电压、短脉冲时间、多次脉冲可有效避免细胞损伤。多次脉冲建议中间间隔1min。 3细胞因素 用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞（15代以内，传代后2d）。因为处于对数生长期的细胞分裂旺盛，表面结构致密比稳定期的细胞差，电转后，细胞膜的恢复能力强，而且处于有丝分裂期的细胞更容易接受外源DNA.细胞悬液浓度一般为1*106/ml，当细胞生长密度大于3*106/ml，转染效率会下降。原因除了细胞老化外，细胞过密会使相邻细胞相互作用增大，甚至使细胞相互融合，从而导致电场的局部微扰，使电场环境无法均一化，细胞体积越大对电击越敏感，所需电场强度也越小。 4 质粒因素 从质粒浓度看，细胞密度为1*106/ml，DNA用量在2-5ug/ml转染效率最高。转染率在一定一定范围内随质粒浓度的上升呈线性增高，但是到达一个峰值后，随DNA用量增加而转染率逐渐下降，其原因可能为细胞吸纳DNA有一个饱和度，过量便会产生毒性，使存活率降低，不利于转染率提高。 进行小分子量的分子转染时（siRNA/miRNA），应使用高电压、短脉冲时间。大分子量分子转染时（DNA），应使用低电压，长脉冲时间。 从质粒的纯度看，用高纯度的DNA才 能提高电转的效率，且应注意以下几点：首先DNA／RNA应该超纯(A260／A280>1．8)，其次应不含内毒 素，同时质粒应溶于双蒸水而不是TE缓冲溶液。 5 温度 一般情况下，电转的过程是在室温下进行，但在 电击前后可对细胞进行冰浴处理。电击前冰浴的时间对转染率影响不大，但低温环境能够防止DNA被外源性DNA酶降解，并限制在电击中因Joule作用而产生的不良反应，因此，实验一般选择电击前冰浴5min。电击后冰浴，会影响DNA摄入，因为电击后冰浴可增强细胞收缩，细胞膜上的 电穿孔封闭较慢，延长外源性DNA摄入时间，从而提高其摄入量。在室温环境下，虽然细胞膜上的孔 封闭速度快，但在随后2h，质粒还可通过电内化进入细胞，因此摄人量不一定比4℃环境下低。而且，室温下细胞在5 min内即闭孔，在4℃的环境下穿孔状态可保持4h，穿孔封闭缓慢降低了存活率，同时细胞在低温下更容易受到损伤。 因此，综合考虑摄人量和存活率，大部分文献倾向于电击后细胞仍在室温或37℃下保存。 6电转染试剂的选择 电击会对细胞造成一定程度的伤害，在转染试剂的选择上要注意，应选择具有细胞膜修复成分的电转染试剂，如Entranster-E，将电击对细胞的损伤降到最低。 7电转后培养液的选择 细胞在电击后十分脆弱，其 培养液的选择应注重提高细胞的存活率，一般选择 低渗的RPMI 1640+10％FCS。除此之外，可参考 加入50 mmol／L海藻糖+1.25％DMSO，因为海藻 糖具有稳定DNA、蛋白质以及细胞膜的作用，并提高电转后细胞特别是淋巴细胞的存活率。此外， 有文献显示凋亡是细胞电击后死亡的主要原因，电 击后的培养液还可加入Caspase抑制剂和SCFGM-CSF等细胞因子。 |
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2楼2019-05-14 17:10:18
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