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qPCR过表达成功为何western跑不出flag？已有1人参与
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已有表达某白血病融合基因A的测序成功的质粒（MSCV-A-flag-IRES-GFP），包病毒后感染正常小鼠骨髓细胞系，感染后48hGFP阳性率不高在15%左右，分选GFP阳性细胞到80%左右的阳性率后拿混合克隆进行了qPCR和western验证。qPCR用融合基因A的引物能正常扩增，且相对表达量比空载组高3000倍，PCR产物琼脂糖凝胶电泳也能看到明显过表达的条带。由于没有该融合基因A的直接抗体，因此用flag抗体跑western，过表达组只有1次能见到非常弱的flag条带。 然而最想不通的问题在这里—— 上面的混合克隆用流式分选单克隆后养了2周（此时GFP阳性率接近100%）再做qPCR和western，qPCR过表达了一万多倍（显然比混合克隆高很多），但是western跑了七八次（同样的flag抗体）就是未见过表达组有flag条带。此外，我想要研究的蛋白B，在单克隆组（随机取了4组单克隆）和混合克隆组的表达结果也接近相反（混合克隆中过表达融合基因A组显著高表达B，而单克隆中过表达组的B表达量反而低一些。基因层面很明显，蛋白层面不太明显）。 求助大家！！！ 1）为何基因层面过表达明显但蛋白层面几乎看不出过表达？flag标签蛋白会丢失吗？ 2）目的基因B在单克隆和混合克隆中的表达情况不一致，应该以哪个结果为准？ 如有想法请告知！新手实验小白缺乏经验，请大家帮忙！谢谢大家。 发自小木虫IOS客户端 |
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嵩波魔飘
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2楼2020-05-18 07:20:23
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蛋白质过表达出来是指没有条带吗？是不是封闭没做好或者提取蛋白质的时候蛋白质已经降解了？3楼2020-05-18 09:01:37