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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 关于pet28a双酶切
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wangpei2433

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于pet28a双酶切 已有2人参与

有用HindIII与EcoRI双酶切pet28a质粒的嘛？我用NEB快切酶，35切2h，跑电泳只能看到一条5000多的条带，不知道能不能切好啊。目前做连接老是连接不上，所以考虑是不是载体没切好。
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1楼 2019-02-19 09:44:36
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
引用回帖:
3楼: Originally posted by wangpei2433 at 2019-02-20 08:58:19
因为跑胶能看出来切开了，但是是不是双酶切就看不出了，我做了好几次连接，涂板之后都不能长菌落，所以猜测是不是质粒没切开。感受态是新的。应该没有问题。
...

如果没有切开，正常情况下应该会有假阳性菌落出现的，不会一点都不长，我猜应该是没连上或者转化出了问题，你可以用pet28做一个转化的对照，看看是不是转化或者培养基配置的问题
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···
4楼2019-02-20 09:04:08
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这两个酶切还好吧，应该没问题，如果不是鉴定，而是连接片段，可以适当延长酶切时间，防止没切开质粒的污染，跑胶的时候大小对就可以
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···
2楼2019-02-19 12:47:23
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wangpei2433

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小冀- at 2019-02-19 12:47:23
这两个酶切还好吧，应该没问题，如果不是鉴定，而是连接片段，可以适当延长酶切时间，防止没切开质粒的污染，跑胶的时候大小对就可以

因为跑胶能看出来切开了，但是是不是双酶切就看不出了，我做了好几次连接，涂板之后都不能长菌落，所以猜测是不是质粒没切开。感受态是新的。应该没有问题。

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3楼2019-02-20 08:58:19
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狗狗狗尾巴草

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小冀-: 金币+1, 鼓励回帖交流 2019-02-20 20:02:47
连接之前需要测质粒和片段的浓度，根据不同的连接酶确定两者的比例以及总核酸量。一般情况下质粒和片段比例在1：5-1：7之间；总核酸浓度最好不超过200ng，连接效率是比较高的。你可以参考下
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5楼2019-02-20 19:59:49
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