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如何解决细胞培养中的支原体污染？
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一说起支原体，估计细胞培养的人员就开始手心冒汗了。细胞培养中的急性污染往往容易察觉，而支原体则像慢性毒药一般，杀细胞于无形中。除了非常有经验的老手，很多实验人员都察觉不到支原体的污染。据统计，超过25%的细胞系中感染了支原体，而研究者大多并不知晓。早期，血清可能是主要的污染源；之后，通过实验室的仪器、培养基或其他试剂渐渐蔓延开来，细胞无不中招。怎样才能根除讨厌的支原体污染呢？ 支原体生长缓慢，通常不破坏宿主细胞。然而，它们能以许多不同方式改变细胞的新陈代谢。细胞除了长得不好之外，几乎所有的实验表现如蛋白表达也都会受到影响。传统的抗生素对支原体并不奏效，因为它们大多破坏细胞壁的完整性，而支原体恰恰没有细胞壁。这也就是支原体感染率高的主要原因。曾有一位细胞培养专家戏称：“我可是支原体方面的专家，并不是因为我喜欢他们，而是25-60%的细胞系都感染了支原体。”支原体总在偷偷地改变细胞，篡改我们的实验数据。怎么办？ 检测、检测、再检测 对培养物进行常规的支原体检测非常重要。尽管各个实验室的检测频率不同，从几个星期到几个月不等，不过这主要取决于你们实验室有多少人接触细胞，以及你们引进新细胞的频率。比如美国国立细胞培养中心（NCCC），它经常从其他实验室获得细胞培养物，就会对每个样品进行检测，并将它们隔离，直至最后证明无支原体污染。一般来说，每两三个月进行一次定期检测是必要的。如果有新细胞进入实验室，或准备将细胞进行液氮保存，都应该进行检测。当然，如果细胞不大对劲，应立马检测。 检测频率是一方面，选择合适的检测方法也很重要。到底是PCR、生化分析、ELISA还是免疫荧光呢？PCR应该算是检测支原体的理想方法，它综合了几个优势：灵敏、特异、快速、廉价等。细胞培养上清可直接用来检测，非常方便。Sigma-Aldrich公司的LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit，扩增的就是支原体基因组上16S核糖体RNA基因。此区域高度保守，因此可检测多达19种支原体。当然，为了避免假阳性和假阴性，实验中必须设立多种对照：阳性对照、阴性对照和内对照。如果电泳图上出现259bp的清晰条带，对不起，你中招了。以色列Biological Industries（BioInd）公司的EZ-PCR Mycoplasma Test Kit也能提供支原体的快速检测，引物与Sigma类似，也是扩增16S rRNA。这个试剂盒的灵敏度颇高，M. capricolum的检测极限为5.5 CFU/ml，M. hyorhinis则为10.5 CFU/ml。 Stratagene新的MycoSensor QPCR Assay Kit通过实时定量PCR的方法来检测最低10个拷贝的支原体，连跑胶的时间都省了，整个过程只需要2小时。阳性PCR产物的Tm值为85C，而内对照为82C，通过熔解曲线分析能将两者区分开。另外，Stratagene也提供了PCR检测支原体的试剂盒。 如果你对杂交过程得心应手，还可以选择R&D公司的MycoProbe Mycoplasma Detection Kit。它利用标记了碱性磷酸酶的寡核苷酸探针与16S 核糖体RNA杂交，随后用显色底物就能了解支原体的存在。整个过程只需4.5小时，也还算快，能检测8种最常见的支原体。 用Hoechst 33258染料检测支原体是很多教科书推荐的方法。由于支原体含有DNA，能与Hoechst 33258染料结合，在500倍放大情况下，表现为细小颗粒或纤毛染色。但操作过程较繁琐，且需要一定的经验来辨别支原体，新手可能不大容易掌握。 特别值得一提的是：最近笔者尝试采用一种由我国苏州先达基因公司研发的支原体试剂盒，其原理是基于公司自主开发的实时荧光恒温核酸检测技术（ERA），可以在恒定的低温下（25℃-42℃）对痕量的支原体种内保守性DNA片段进行特异性的扩增，扩增反应可以在20min内完成，该试剂盒检测范围涵盖130种支原体，灵敏度也比较高，是普通PCR的10-1000倍，操作简便。 不过，预防支原体的最佳方法还是良好的细胞培养技巧和正确的态度。虽然这些都是老生常谈，但一旦熟悉了细胞培养，就很容易麻痹大意，时常敲敲警钟还是相当必要的。 |
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