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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助，有关高保真酶
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elvias

铁杆木虫 (正式写手)
有两种方法可以对3'- 末端进行加-A.

A. 这种方法需要的时间比较长, 但T/A 克隆成功的比率很高.
设置一个 50μl的反应体系。
胶回收平末端 PCR产物 （建议纯化，否则残留的pfu仍会其作用，将加上的A去掉）
5μl 10×Tag DNA Polymerase Buffer
4×dNTP 或dATP 至终浓度为200nM （建议使用dATP)
2.5U Tag DNA Polymerase
加水至终反应体积为 50μl
72℃ 保温10min
纯化 PCR片段T/A 连接

B. 这一方法速度快，但成功率不高。
PCR 反应（50μl 反应体积）结束以后，加入1μl 20mM dATP 和2.5U 的Tag 酶，72℃ 保温10min ，然后进行直接T/A 连接
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11楼2009-05-07 19:36:14
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huanshi

银虫 (小有名气)
非常感谢各位朋友的帮助。。。

个人非常赞同elvias 的观点，我们实验室以前用过takara的Pyrobest，没什么问题。。

因为实验室已经有invitogen的Platinum Pfx DNA Polymerase，下午刚找到，所以就直接用了。。

[ Last edited by huanshi on 2009-5-7 at 22:33 ]
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12楼2009-05-07 22:25:43
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