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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 过表达载体测序
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灯火阑珊0818

新虫 (初入文坛)

[求助] 过表达载体测序 已有2人参与

构建过表达载体，pcDNA3.1（-）作为载体，过表片段长度是672bp，Amp作为抗生素，使用的感受态是DH5a，挑取单个菌落，37°C，220转摇菌12h，自己做了菌液PCR，可以跑出目的条带，但是有的有杂带有的没有杂带，总共选择七只送出去测序，但是最后反馈的结果都是样品浓度低，无信号，想知道是什么原因，或者可能是什么原因以进行排除，恳请各位指导
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好好吃饭，天天长肉
1楼 2019-01-28 11:33:20
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包包大包子

新虫 (初入文坛)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2019-02-13 20:35:33
那就是浓度低阿  回收的时候几管合并成一管，提高浓度

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2楼2019-01-28 12:01:51
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懦弱的青春

捐助贵宾 (小有名气)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2019-02-13 20:35:44
提的质粒自己有没有测个浓度啊？如果酶标仪测的浓度挺高，但测序测不出是否考虑假阳性？个人观点，以供参考。

发自小木虫Android客户端
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3楼2019-01-28 14:03:07
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lizimu566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
灯火阑珊0818: 金币+3, ★★★★★最佳答案 2019-01-29 15:48:07
提质粒酶切验证，之后在测序
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4楼2019-01-29 09:11:32
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a13515517892

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
灯火阑珊0818: 金币+3, ★★★★★最佳答案 2019-01-29 15:48:13
即便是浓度低测序公司也有会有一些办法可以调整测序方案的，而且测序是通过pcr的办法，你样品浓度那得低到什么程度才不能测出来啊。所以我觉得不是这个问题，很可能是你提供的样品是污染的或者说就不是目的基因的序列，导致测序无信号的
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5楼2019-01-29 11:18:30
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灯火阑珊0818

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by a13515517892 at 2019-01-29 11:18:30
即便是浓度低测序公司也有会有一些办法可以调整测序方案的，而且测序是通过pcr的办法，你样品浓度那得低到什么程度才不能测出来啊。所以我觉得不是这个问题，很可能是你提供的样品是污染的或者说就不是目的基因的序 ...

是的，假阳性
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好好吃饭，天天长肉
6楼2019-01-29 15:46:45
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灯火阑珊0818

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lizimu566 at 2019-01-29 09:11:32
提质粒酶切验证，之后在测序

酶切完就没有条带了
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好好吃饭，天天长肉
7楼2019-01-30 09:55:22
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lizimu566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 灯火阑珊0818 at 2019-01-30 09:55:22
酶切完就没有条带了...

那质粒构建有问题啊啊
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8楼2019-01-30 10:36:10
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灯火阑珊0818

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by lizimu566 at 2019-01-30 10:36:10
那质粒构建有问题啊啊...

重新涂板，挑菌，测序测出来啦，多谢
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好好吃饭，天天长肉
9楼2019-02-01 10:44:20
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丽媛FOOD
引用回帖:
9楼: Originally posted by 灯火阑珊0818 at 2019-02-01 10:44:20
重新涂板，挑菌，测序测出来啦，多谢...

恭喜
10楼2019-02-20 21:49:35
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