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悬浮细胞siRNA转染步骤
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悬浮细胞的siRNA转染操作步骤，以24孔板siRNA转染为例 1.提前1天细胞种植 悬浮细胞：采用对数生长期的细胞，数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。如某细胞常规培养的细胞数是6×105，那么就用2×105的细胞进行转染。 2.转染过程 ⑴取0.67ug(50pmol)的siRNA，加入一定量无血清稀释液，充分混匀，制成RNA稀释液，终体积为25μl。 注意：无血清稀释液建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640。 ⑵取1ul的EntransterTM-R4000，然后加入24ul无血清稀释液体，充分混匀，制成EntransterTM-R4000稀释液，终体积为25μl。室温静置5分钟。 ⑶将EntransterTM-R4000稀释液和RNA稀释液充分混合（可用振荡器振荡或用加样器吹吸10次以上）混合，室温静置15分钟。转染复合物制备完成。 ⑷将50μl转染复合物滴加到有0.45ml全培养基（可含10%血清和抗生素）的细胞上，前后移动培养皿，混合均匀。 注意：对本试剂，采用含血清的全培养基有助于提升转染效率。 ⑸转染后6小时观察细胞状态，如状态良好可不必更换培养基，继续培养24-96小时得到结果。 注意：1.siRNA转染后，继续培养24-72小时在mRNA水平得到结果，继续培养24-96小时在蛋白水平得到结果。mRNA转染后，根据需要在24小时后得到结果。 2.在部分实验室，由于血清和培养条件等差异，转染后镜下培养基中可能出现少量黑点状沉淀，为转染试剂和血清中蛋白结合产物，不影响转染结果和细胞状态，可通过换液除去。 |
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