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白利利

铜虫 (小有名气)

[交流] 酶切问题

求助:酶切问题
如电泳图
孔道:1    :5833bp的质粒 KPNI与ECORI双酶切,管1
孔道:2   : 5833bp的质粒 KPNI单酶切
孔道:3:M 1000,最亮的为5000bp,其余t条带大小为从1000-10000bp
孔道:4 :  5833bp的质粒 ECORI单酶切
孔道:5:   5833bp的质粒 KPNI与ECORI双酶切,管2
孔道:6:M 1000,最亮的为5000bp,其余t条带大小为从1000-10000bp
孔道:7:6615bp的质粒双酶 KPNI与ECORI切,管1
孔道:8:6615bp的质粒 KPNI单酶切
孔道:9:M 1000,最亮的为5000bp,其余t条带大小为从1000-10000bp
孔道:10:6615bp的质粒 ECORI单酶切
孔道:11:6615bp的质粒双酶 KPNI与ECORI切,管2
孔道:12:MDL2000,:条带:100,250,500,750,1000,2000.
其中我所需要的回收的条带为:5833bp双酶切后,余下的5801bp的条带
和6615bp质粒双酶切后,余下的5822bp的条带。
但是看我的电泳图,不管单双酶切好像能切下很多条带,请问这种酶切情况是否正常?在这样的酶切情况下,我只回收我所需大小的条带能否用于后面的连接试验?连接两个月了,一直没进展,不知是那步出错,还请各位老师指导,不甚感激。在线等待您的解答。先谢过啦 !
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天道酬勤
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白利利

铜虫 (小有名气)

谢谢各位虫友的帮助,我之后用没有酶切的质粒一起跑了电泳,验证是没有切干净,有残存的质粒存在,其他的杂带有的是质粒的三种形式中的一种,失误啊  ,谨记对照的重要性啊  。。。。
天道酬勤
4楼2009-05-11 20:21:51
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yang0071

木虫 (职业作家)

建议你酶切的质粒量可以少一些,
现在的量太大了,酶切效率很低,不排除还有其它原因
孔2 4 8 10 来看你的质粒都会被切成2断,这个估计是导致你实验一直不成功的原因
还有一种可能是你酶的质量不好或者有星号活性,导致切出2个的
2楼2009-05-06 15:27:45
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anik

银虫 (正式写手)

质粒量太多了。酶的质量应该没有什么问题的吧。
确保所用酶是唯一的位点?
单酶切倒是比双酶切的条带还要多。。。。有没有可能是顺序错了?
3楼2009-05-06 15:46:11
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