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蛋白测定方法都有什么啊？
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做实验，知道WESTERN BLOT法，但是不知道其测定蛋白的量的范围是多少？ 还有没有其他测定方法，范围是多少？ |
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jiaminl
铁杆木虫 (知名作家)
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实验八 蛋白质的定量测定（三）——紫外（UV）吸收测定法 目的要求 （1）了解紫外吸收法测定蛋白质含量的原理。 （2）了解紫外分光光度计的构造原理，掌握它的使用方法。 实验原理 由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（A280）与其含量成正比关系，可用作定量测定。 利用紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速，简便，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，在蛋白质和酶的生化制备中（特别是在柱层析分离中）广泛使用。此法的缺点是：（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差；（2）若样品中含有嘌呤，嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。 不同的蛋白质和核酸的紫外线吸收是不同的，即使经过校正，测定结果也还存在一定的误差。但是可作为初步定量的依据。 试液和器材 一、标准和待测蛋白质溶液 1.标准蛋白溶液 结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度配制成1mg/ml蛋白溶液。 2.待测蛋白溶液 配制成浓度约1mg/ml的待测蛋白溶液。 二、器材 紫外分光光度计，试管和试管架，移液管。 操作方法 一、标准曲线法： 1.标准曲线的绘制 按下表分别向每支试管加入各种试剂，摇匀。选用光程为1cm的石英比色杯，在280nm波长处分别测定各管溶液的A280值。以A280值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。 1 2 3 4 5 6 7 8 标准蛋白质溶液/ml 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 蒸馏水/ml 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0 蛋白质浓度/(mg/ml) 0 0.125 0.250 0.375 0.500 0.625 0.750 1.00 A280 2. 样品测定 取待测蛋白质溶液1ml，加入蒸馏水3ml，摇匀，按上述方法在280nm波长处测定光吸收值，并从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。 注意事项 不同蛋白质酪氨酸的含量有所差异， 蛋白溶液中存在核酸或核苷酸时会影响紫外吸收法测定蛋白质含量的准确性，尽管利用上述公式进行了校正，但由于不同样品中干扰成分差异较大，致使280nm紫外吸收法的准确性稍差。 思考题： 1. 本法与其他测定蛋白质含量的方法相比，有哪些优点？ 2. 若样品中含有干扰测定的杂质，应该如何校正实验结果？ |
5楼2009-05-05 21:41:27
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所谓乳和乳制品中“真蛋白测定方法”就是“蛋白测定方法”。实验室常用考马斯亮蓝G-250法，不是以测定"氮"含量为基础。马斯亮蓝是一种甲基取代的三苯基甲烷，分子中磺酸基的蓝色染料，在465nm处有最大吸收值。考马斯亮蓝G-250能与蛋白质通过范得华相互作用形成蛋白质-考马斯亮蓝复合物蓝色溶液，引起该染料的最大吸收λmax的位置发生红移，在595nm处有最大吸收值。由于蛋白质-考马斯亮蓝复合物在595nm处的光吸收远高于考马斯亮蓝在465nm处的光吸收，因此，可大大地提高蛋白质的测定灵敏度。蛋白质-考马斯亮蓝复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。利用溶液颜色的差异进行比色测定，适合于蛋白质类的定量分析，呈色反应颜色稳定、灵敏度高，最低测试蛋白质量在1ug左右。但是考马斯亮蓝G250分子含苯环。 也可以用“紫外吸收法”，它也不是以测定“氮”含量为基础，其中以280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。其原理是蛋白质分子中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比，利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定，三聚氰胺等化合物含有共轭双键的苯环，但是没有肽键，所以238nm处的吸光度值可以排除其它苯环共轭双键的干扰。 |
3楼2009-05-05 20:19:32
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.1 选用高灵敏度的尿总蛋白定量测定法 有关资料表明肾损伤早期尿蛋白的增加主要是尿白蛋白的增加，因测定尿中总蛋白与单独测定尿中白蛋白有80%的相关性 ［17］ ，故无条件测定尿中特种蛋白的单位可选用高灵敏度的尿总 蛋白测定法作弥补，如考马斯亮兰法、邻苯三酚红-钼酸钠法、丽春红-S法等。但这些方法有的操作太繁杂、结果变异较大，有的染料对比色杯等污染严重。为此，笔者根据邻苯三酚红不着色比色杯和污染环境的优点 ［18］ ，建立了用该染料简易、快速测定尿中总蛋白的方法 ［19］ ，特别适合在体检和普查中使用。 2 测定尿中清蛋白 尿清蛋白排泄率95%可信上限为20μg/min，以20～200μg/min（30～300mg/24h）为微量清蛋白尿，作为糖尿病肾病的早期预测指标，已被国内外公认。我们研究的用溴酚兰指示剂快速筛选尿中清蛋白法 ［20］ ，不须特殊仪器和试剂，简易快速、特异性强、不受尿中常见物质的干扰，对肾早期损伤的监控效果良好。 3 用高灵敏度的白蛋白试剂带法 德国宝灵曼公司研制的Micral-TeST白蛋白测定试剂带，检测范围为0、10、20、50、100mg/L，也简易快速。 |
4楼2009-05-05 20:21:18
jiaminl
铁杆木虫 (知名作家)
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6楼2009-05-05 21:41:53
