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[交流]
siRNA转染过程中常见问题及解答
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问：siRNA导入细胞有哪些方法，哪种最好？ 答：siRNA导入细胞有以下几种方法：化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。选择时应该依据实验条件考虑以下因素：细胞对转入方式的承受能力、细胞对病毒侵染的易感性、细胞的生长特性等。对贴壁细胞来说化学转染技术是最为常用的方法，而对悬浮细胞则采用电穿孔法效果较好。 问：哪种转染试剂效果好？ 答：在选择转染试剂时，一般要考虑的是特定的细胞株，而不是被导入细胞中的物质。脂质体试剂的毒性较大，建议选择非脂质体的转染试剂，如Entranster系列试剂。 问：如何筛选转染试剂？ 答：好的转染试剂有以下特点：1、对siRNA有较高的转染率；2、对细胞的毒性小。在mRNA水平检测siRNA导入的效果比用看家基因的siRNA阳性对照检测更为准确。 问：在转染时我发现有不少细胞死亡，应该如何处理？ 答：转染后大多数细胞死亡表明：转染条件需要进一步地优化。在优化转染条件时需要考虑以下因素：转染试剂和细胞特有的自身条件。例如：siRNA与转染试剂的比例、转染时间、细胞传代数和细胞密度等。 问：对于难转染的细胞，应该如何提高其转染效率？转染效率又该如何确定？ 答：对于难转染的细胞的转染，如何提高转染效率的问题也是目前研究的技术难题。一般建议使用电转的方法，但是由于电转的方法对细胞损伤比较大，该方法也未必是最佳的。转染效率的确定，常用的是使用荧光标记的siRNA，通过荧光显微镜，共聚焦显微镜，流式细胞仪检测的方法。 问：转染后出现细胞死亡是什么原因？如何优化转染条件？ 答：转染后细胞死亡，原因也是多样的，如脂质体毒性，转染浓度过高，转染前的细胞状态不佳等都可能导致转染后细胞死亡的情况发生，这种情况下就需要适当优化转染条件；可以选择细胞毒性小的非脂质体类的转染试剂，如Entranster试剂，另外，如果siRNA所靶向的基因对于维持细胞生长是非常重要的，出现细胞死亡的现象可能正是由于基因干扰引起的，如果由于细胞死亡而影响检测的话，可以适当调整检测时间。实验条件的优化，包括转染前细胞密度调整，转染浓度，检测时间等。 |
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