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求助：细胞转染后western测到很多条带，求解？
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我用的是pcDNA4质粒，外源蛋白C端带有myc标签，大小应该是48kd左右。转染293T细胞48小时后用myc抗体检测，western blot在60和40之间显示有三条带，其他位置的应该是杂带 。然后我做了一个时间梯度，分别在转染后 18h,28h,48h,78h取蛋白，结果如图： 左面曝光1分钟，右面曝光10秒。 请问，为什么会出现越来越多的条带呢？如果说蛋白降解，那为何不是连续的一片而是多条可以区分的带呢？如果说是蛋白修饰，那可能是什么修饰呢？ 小女在此谢过各位啦！ |
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elvias
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3楼2009-05-03 23:50:04
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baisuilan(金币+2,VIP+0):谢谢斑竹提供的建议，可否给我个protocol? 5-4 00:07
baisuilan(金币+2,VIP+0): 5-9 15:34
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baisuilan(金币+2,VIP+0): 5-9 15:34
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这个原因有几种：是不是你的antibody浓度太大了？或者是isoform？你可以一用+antigen的方法看看拿一条是特异性的带（简单的说就是过量的抗原+少量的抗体，37度一般是两个小时，然后离心去沉淀，之后，拿上清当作抗体，做法一样），还有就是你那纯化的抗原（表达蛋白）做一个对照，看看条带如何？ the protocol as follows: 1 determine the amount of antibody thai is needed for 1 strip(2ml),for example if 1:1000 dilution,so you will need 1ul/ml antibody,or if 1:5000 dilution then you would only need 0.2ul/ml 2 take 2ul antibody (or as needed) in 100ul salline/PBS .make two tubes.Add antigen/peptide solution (10-50ug peptide or antigen added in 10-100ul).Add same volume of saline/PBS(no peptide or antigen) to other tube labeled as -peptide or NO peptide, mix gently. 3incubate both tubes at 37oC for 1-2 hrs or 4oC 2-24hrs 4centrifuge the tubes for 15min at 4oC in a microfuge(10-15000rpm) to pellet any immune complexes.Carefully remove the superantant, if no visible pellet is seen than just pleave approx 5-10ul at hte bottom to avoid disturbing invisible immne complexs.if you do not centrifuge the solution it may give high background. 5 after centrufugation,make up the volume of supt to 2ml (or what is necessary depending upon the initial antibody taken)with buffer (PBS Tween with or without BSA or milk or any buffer that was used initially).use both batibodies for western botting or immunolocalization. so much for these [ Last edited by sutao1979 on 2009-5-4 at 16:58 ] |
2楼2009-05-02 21:27:59
斑竹大人能在此详细介绍一下，或者给个链接么？4楼2009-05-03 23:59:54
elvias
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