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erictan2046铜虫 (正式写手)
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[交流]
[求助]我想请问各路高手有效提取质粒的方法？？
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我想请问一下，最近我一直提取质粒，琼脂糖的凝胶电泳跑出来的效果都不好。。。。我的菌株是大肠杆菌，我想请问一下，怎么才能有效的提取质粒？？？我用的都是质粒小量提取试剂盒（生工）BBI产品的。。。。。 怎么才能提取更多的质粒呢？？？？我的提取效果都不好！电泳跑出来的条带都很淡。 |
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碱法少量快速抽提质粒DNA 1. 挑取单菌落接种于含Amp或Kan（80ug/ml）的3mlLB培养基中，37℃振荡过夜。 2. 将菌液倒入e p 管中，倒完后及时盖上盖，防止污染。不要倒过。1000r/min离心1min,弃上清。（转速不要太高，否则不好弹）（可长时间放置） 3. 加solution I（4℃冷藏）150ul，振荡弹起。（旋涡混合器混合），冰上放置10min. 4. 加solution II 300ul ，再加入50ul 氯仿（沉淀蛋白）。轻轻倒转混匀，冰上放置10min. 5. 加入solution III 450ul ,剧烈震荡均匀，冰上放置10min , 12000r/m ,10 min, 取上清液，倒入新的 ep 管中。（离心时间长是为了直接倒，以免入氯仿，影响酶切）。 6. 加入0.6 mol./L 异丙醇（室温）450 ul ,混匀（-20℃更好）后冰上放置20min，12000rpm 离心，弃上清。（可长时间放置） 7. 沉淀溶于250ul TER（含20ug/mLRnaseA的1×TE）中，37℃培养，消化20min. 8. 加入300ul ppt.Buffer沉淀，混匀，置冰上20min，12000rpm,10min。弃上清。（可长时间放置）。 9. 用70%乙醇（冰）洗一次1mL,12000rpm , 10min,弃上清，然后放入37℃培养箱中干燥。（注：加入乙醇后直接离心，不必弹起沉淀，乙醇用来洗盐，弹起后反而不紧，使DNA丢失） 10. 干燥后加0.1mol/L TE.Buffer(pH8.0)100ul溶解，-20℃保留备用。（干燥后加双蒸水也可） |
5楼2009-05-02 20:36:35
sutao1979
木虫 (著名写手)
小木虫10年groupleader
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2楼2009-05-02 15:47:57
3楼2009-05-02 16:14:57
三磷酸腺苷
铁杆木虫 (职业作家)
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6楼2009-05-02 20:59:35
