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大肠杆菌、幽门螺旋杆菌中Dps蛋白表达纯化及其功能研究
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Dps（DNA protection during starvation）蛋白是细菌中特有的一类具有铁离子结合功能的蛋白，它能保护细胞应对包括过氧化氢、金属毒性、低PH和高温等多种逆境压力。大肠杆菌及幽门螺旋杆菌重组Dps蛋白表达纯化研究，为研究Dps蛋白功能提供了理论依据，理解Dps的作用可能有助于人们开发出具有更强靶向性的抗生素和其他的药物疗法。 耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans，DR)是目前世界上已知最强的抗辐射生物之一，以其对于电离辐射等诸多逆境因素的超强耐受和抵抗力而著称，其抗性机理主要可归因于其特殊的物质结构和生存方式、对DNA损伤的精确高效修复以及卓有成效的抗氧化体系。Dps蛋白是DR菌抗氧化体系的重要成分，大肠杆菌和幽门螺旋杆菌中均有Dps蛋白。蛋白表达是指用模式生物如细菌、酵母、动物细胞或者植物细胞表达外源基因蛋白的一种分子生物学技术，在基因工程技术中占有核心地位，美迪西提供蛋白表达服务。 1、大肠杆菌Dps蛋白表达纯化研究 细菌引起许多严重疾病，如食物中毒和肺炎。科学家们面临的挑战是，引起疾病的细菌是非常有弹性的。比如，当诸如大肠杆菌之类的细菌经历饥饿时，它们会大规模地重新组装它们的DNA，从而使得它们能够在应激条件下存活下来。 为了实现这一壮举及提高存活机会，大肠杆菌菌株显著增加一种被称作Dps的蛋白的数量。构建表达载体p BVDPSHis，诱导表达并纯化DPS单体蛋白，通过非变性PAGE检测DPS单体自组装情况，通过质粒在Fenton反应时的降解情况检测DPS对DNA的抗氧化保护作用。 结果表明，PCR扩增得到522 bp的特异性基因片段，成功构建表达载体p BVDPSHis，诱导表达了分子量为19.5 kD的Dps单体蛋白，亲和层析法纯化的单体DPS经非变性PAGE电泳证实以多聚体蛋白形式存在，Fenton反应说明Dps具有保护质粒DNA抗氧化损伤作用。原核表达的DPS在体外可以自组装成多聚体结构具有抗氧化保护DNA作用。 2、幽门螺旋杆菌Dps蛋白表达纯化研究 幽门螺杆菌是一种螺旋状，革兰阴性、微需氧性细菌。人群中几乎一半终身感染，感染部位主要在胃及十二指肠球部。目前已知幽门螺杆菌感染的发病率的高低与社会经济水平，人口密集程度，公共卫生条件以及水源供应有较密切的关系。我国有研究者进行了幽门螺杆菌Dps蛋白表达纯化及活性测定研究。 依照Dps蛋白的基因序列，设计PCR引物，并以幽门螺杆菌基因组DNA为模板扩增Dps基因。将扩增产物回收后连接到pET15b然后转化大肠杆菌，涂布在抗性平板，37℃过夜培养，然后使用PCR和测序验证阳性菌落。使用IPTG诱导重组Dps蛋白表达，并通过Ni2+亲和层析纯化。测试Dps蛋白的亚铁氧化酶活性和抗氧化功能。 结果通过PCR获得全长为438 bp的Dps基因，成功构建重组质粒pET15b-Dps，它能编码分子量为18.9 kDa的重组Dps蛋白。使用IPTG诱导目的蛋白表达，然后纯化得到Dps蛋白。Dps蛋白能够快速催化亚铁离子生成铁离子。与对照BSA蛋白相比，Dps蛋白具有较强的抑制氧自由基生成的活性。因此构建了重组质粒pET15b-Dps，纯化获得Dps蛋白并测定了其亚铁氧化酶活性和抗氧化活性。 此外大肠杆菌DNA结合蛋白克隆表达纯化及体外自组装功能研究表明：Dps蛋白既能通过亚铁氧化酶活性结合铁离子对氧化压力做出应答，又能在氧化并储存铁的同时去除了H2O2与Fe（Ⅱ）的毒性，从而保护DNA、蛋白及膜脂免受自由基损伤。另外，在铁、铜、辐射、高盐、酸、碱、饥饿或营养不足等胁迫时，一些细菌的Dps蛋白还能非特异性结合DNA，形成一个高度有序且稳定的Dps-DNA复合体，使得染色体从松散易受损伤形态转变为凝集紧实状态，从而保护DNA免受各种因素的损伤。 然而Dps蛋白能够通过自组装机制成十二聚体发挥相关功能，但自组装过程的机制与条件尚不明确。因此研究Dps蛋白的自组装机制，找到其聚合与解聚条件，有助于深层次揭示其蛋白功能，并在生物纳米技术以及免疫治疗方面发展其可能的应用。 |
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