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浅析重组抗体及其片段的分离纯化方法 已有2人参与
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抗体是人体中一种浆细胞所分泌的一种蛋白质，在生产阶段，抗体一般都存在于复杂的细胞中，而且它们的大部分应用都需要纯化后使用。重组抗体及其片段的分离纯化相对其他重组蛋白纯化来说较为简单，理想的纯化方法可从重组大肠杆菌蛋白粗提液中一步获得足够纯度的抗体产物，因此纯化方法的合理选择尤为重要。蛋白分离纯化的一系列过程旨在从复杂的混合物中分离出单种类型的蛋白。蛋白分离公司可以提供多种纯化系统，用于简单的蛋白分离和纯化。 抗体可以鉴别人体免疫系统中一些外来物质，比如说病毒、细菌等，所有的抗体都属于免疫球蛋白，从而可以说抗体就属于蛋白质，不过不是所有的蛋白质都是抗体。抗体不断被用于各种科学研究工作，包括但不限于基础研究，色谱分析，靶向分析，成像，诊断和治疗。然而这些应用大多数需要高纯度的均匀抗体。因此，对于来自复杂混合物（例如血浆，血清，腹水，细胞培养基，蛋黄，植物提取物和细菌或酵母培养物）的抗体的纯化，这对于简单、有效和经济的纯化方法的需求不断增加。蛋白分离公司往往会采取亲和层析技术进行蛋白的分离与纯化。美迪西是一家临床前CRO公司，其在重组蛋白表达与纯化服务方面经验丰富，拥有多种蛋白表达系统，包括原核蛋白表达系统、酵母蛋白表达系统、昆虫细胞蛋白表达系统（杆状病毒）哺乳动物细胞蛋白表达系统，具备多种融合技术，可以为客户在蛋白表达与纯化方面提供多种选择。 重组抗体及其片段的纯化大体上可选用下列几种方法： 1、细菌亲和层析法。 亲和层析是常见的重组蛋白纯化方法，它是利用蛋白质结构的特异性，可以与对应的专一分子进行结合，并在特定条件下可以解离，只需一步就可以得到高纯度的蛋白，比如利用酶与底物的结合、受体和配体的结合、抗体和抗原的结合等这些特异结合就可以纯化对应的酶、受体、抗体等蛋白。还可以在重组蛋白表达时，加入标签，如His、Flag、GST、HA、c-Myc、GFP、SUMO、MBP、Avi等。 有些细菌能合成特异性识别并结合高等哺乳动物免疫球蛋白的蛋白质，如蛋白A、B、G 和L，其结合位点主要位于抗体分子的恒定区，只有极少数存在于可变区内，因此这种方法较适用于分离重组抗体完整分子以及单价和双价FAB片段，但对FV或scFV片段的分离无效。 2、抗体亲和层析法 以融合蛋白形式表达的抗体片段常可根据靶蛋白的特性选择合适的抗体亲和层析柱进行分离。目前常用的靶蛋白如碱性磷酸单酯酶、过氧化物酶以及一些毒素蛋白等均有相应的商品化抗体亲和层析介质，但是如果大肠杆菌本身也能合成这种靶蛋白或靶蛋白的同源蛋白，则这种方法的特异性就会受到影响。为了克服这一困难，pIG载体中的Flag和Myc TAG标签序列也可作为抗Flag抗体和抗Myc TAG抗体的靶序列，含有这些序列的融合蛋白可经相应的抗体亲和层析柱进行分离。但是上述抗体价格昂贵，一般只用于实验室规模。 3、抗原亲和层析法 如果与重组抗体或抗体片段相对应的特异性抗原容易获得，那么利用这种抗原亲和层析柱分离表达产物是最佳选择，因为它不仅具有很高的选择性，而且还能从任何非正确折叠的蛋白混合物中快速分离目标抗体或抗体片段。在半抗原亲和层析过程中，分离产物通常需要用可溶性半抗原在非常温和的条件下进行洗脱。然而对于一些具有危害性的抗原（如肿瘤抗原等），一般不宜采取这种方法分离用于体内的抗体片段。 4、配体亲和层柱法 早期用于分离完整抗体分子的磷酸胆碱亲和层析柱也可直接用来从大肠杆菌蛋白粗提液中纯化重组FAB、FV、scFV片段以及各种二价迷你抗体，其前提条件是所有的重组抗体片段必须具有良好的折叠结构。此外，在一些pIG载体上安装的His tag标签序列是专门为表达产物的配体亲和层析纯化工艺而设计的。多肽链中的组氨酸残基能与多种二价重金属离子配合，一级序列中组氨酸残基分布集中的蛋白质理论上均可用二价重金属离子亲和层析柱进行分离，其最佳分离效果在很大程度上取决于金属离子与洗脱剂的搭配，例如Zn２＋ 柱常用二乙酸亚胺溶液洗脱，而Ni２＋ 柱则需用咪唑或三乙酸腈溶液洗脱。由于重金属离子亲和层析介质价格低廉，因此这种方法更适用于重组抗体片段的大规模生产。 亲和层析法作为重组蛋白纯化的一种方法，据与偶特异性、易于操作、相对高的收率和处理量等特点，使其成为最有效率和广泛使用的层析技术，也成了抗体纯化的通用技术。 |
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