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盘点人胰岛素的4大工业生产方法
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大肠杆菌是一种原核表达系统，被广泛用于基因分离克隆、DNA序列分析、基因表达产物功能鉴定等分子生物学研究的各个领域。不断完善的基因操作技术可将大肠杆菌构建成为用于重组异源蛋白生产的分子工厂，而且这种工程菌在价格低廉的培养基中生长迅速易于控制，因此原核表达系统在医用蛋白的大规模生产中具有重要的经济意义。 胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，也是唯一同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素，广泛存在于人和动物的胰脏中，正常人的胰脏约含有200万个胰岛，占胰脏总质量的1.5%。利用基因工程菌可以大规模发酵生产重组人胰岛素，除此以外，胰岛素的生产还可以从人的肝脏中提取、以氨基酸为原料直接化学合成和由猪胰岛素化学转型生产等方法。 1、利用原核表达系统发酵生产重组人胰岛素 由于大肠杆菌繁殖迅速，培养代谢易于控制，利用DNA重组技术构建大肠杆菌工程菌以规模化生产真核生物基因尤其是人类基因的表达产物，具有重大经济价值。在目前产业化的基因工程产品中，相当部分仍由原核表达系统生产。美迪西提供原核表达服务，其科研人员建立了成熟的大肠杆菌表达及纯化服务平台，提供包括各种重组蛋白以及其复合物在大肠杆菌中的表达与纯化服务。 1982年，美国ElyLiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素，这是第一个上市的基因工程药物。5年后，Novo公司又开发了利用重组酵母生产人胰岛素的新工艺。这种由重组微生物合成的人胰岛素无论在体外胰岛素受体结合能力、淋巴细胞和成纤维细胞的离体应答能力，还是在血糖降低作用以及血浆药代动力学方面，均与天然的猪胰岛素无任何区别，但却显示出无免疫原性以及注射吸收较为迅速等优越性，因而深受广大医生和患者的欢迎。 2、从动物和人的胰脏中提取 从人的胰脏中直接提取胰岛素。这种方法在早期用于生产少量的人胰岛素，由于原料供应的限制，其产量不可能满足临床需要。临床使用的胰岛素还可以从猪和牛的胰腺中提取，两者的药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体。 3、以氨基酸为原料直接化学合成 这种全合成方法从技术上来说是能够做到的，我国科学家曾在20世纪60年代成功合成了具有生物活性的牛结晶胰岛素，但不难想象其成本奇高。 1965年9月17日，世界上第一个人工合成的蛋白质——牛胰岛素在中国诞生，在国内外引起巨大反响。当时的中科院生物化学研究所、北京大学、中科院有机化学研究所成功协作完成人工全合成结晶牛胰岛素。自1658年12月正式立项至1965年9科学家观察到人工全合成牛胰岛素结晶，历时近7年。这是世界上第一次人工合成与天然胰岛素分子相同化学结构并具有完整生物活性的蛋白质，标志着人类在揭示生命本质的征途上实现了里程碑式的飞跃，这一成果获，1982年国家自然科学一等奖。 作为一种蛋白质，胰岛素由A、B两条肽链，共17种51个氨基酸组成。人工合成胰岛素，首先要把氨基酸按照一定的顺序连结起来，组成A链、B链，然后再把A、B两条链连在一起，这是一项复杂而艰巨的工作。牛胰岛素合成工作是分三步完成的： （1）先把天然胰岛素拆成两条链，再把它们重新合成为胰岛素，并于1959年突破了这一难题，重新合成的胰岛素是同原来活力相同、形状一样的结晶。 （2）在合成了胰岛素的两条链后，用人工合成的B链同天然的A链相连接。这种牛胰岛素的半合成在1964年获得成功。 （3）把经过考验的半合成的A链与B链相结合，在1965年9月17日完成了结晶牛胰岛素的全合成。最后，通过小鼠惊厥实验证明了纯化的人工合成胰岛素确实具有和天然胰岛素相同的活性，而中国终于也成功地得到了人工合成的胰岛素结晶。原国家科委先后两次组织著名科学家进行科学鉴定，它的结构、生物活力、物理化学性质、结晶形状都和天然的牛胰岛素完全一样，证明人工合成牛胰岛素具有与天然牛胰岛素相同的生物活力和结晶形状。 4、由猪胰岛素化学转型为人胰岛素 由于利用传统的生化方法从猪胰脏中提取胰岛素早已形成生产规模，且成本相对低廉，所以将猪胰岛素在体外用酶促方法转化为人胰岛素不失为一种选择，至少在重组人胰岛素的大规模产业化之前，这种半合成方法仍是相当多生物制药厂家采用的生产工艺。其基本原理是：胰蛋白酶在pH 为6.0～7.0以及苏氨酸叔丁酯的过量存在下能脱去猪胰岛素B 链C末端的丙氨酸，并将苏氨酸转入相应位置；所形成的人胰岛素叔丁酯再用三氯乙酸除去其叔丁酯基团，最终获得人胰岛素，整个过程的总转化率为60%。但是这个工艺路线相当耗时，且需要一整套复杂的纯化方法，导致最终产品的价格不菲。 猪与人的胰岛素只在B 链C 末端的一个氨基酸上存在差异，前者为丙氨酸，后者为苏氨酸，但两种胰岛素的生理功效完全一致，因此一些国家在临床上使用猪胰岛素制剂治疗糖尿病。然而由于氨基酸序列上的微小差异，猪胰岛素的长期使用会在患者体内产生一定程度的免疫反应，更为严重的是，患者体内抗猪胰岛素抗体的诱导生产还可能对患者剩余的正常β细胞功能以及内源性胰岛素分泌造成负面影响。因此，人胰岛素制剂的使用被认为是最理想的糖尿病治疗方法。 综上所述，原核表达系统无疑是各种人胰岛素生产方法当中，较为常见、且普及率最高的方法。因此利用基因工程技术为临床提供质量可靠及价格低廉的胰岛素制品是现代生物医药领域的一项重要工程。 |
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