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运动发酵单胞菌ZM4电转化问题
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各位好，我目前在做运动发酵单胞菌ZM4的电转化，但是一直没有成功，转化的质粒9.7kb，是比较大，后续优化了一下减小到8.6kb。而且开始的时候作为对照的pBBR1MSC-2（5.1kb）有时候还能转化成功，现在也不能转入了。 我一直按照实验室的流程在做，流程如下：将运动发酵单胞菌单菌落接种于5 mL的RM培养基中，30ºC静置培养24 h，取3 mL的培养物接种于100 mL RM培养基中，30ºC静置培养至OD600为0.3-0.4。取100 mL的离心管，将菌液全部倒入其中，离心收集菌体。离心条件设置为4ºC，3,500 rpm，10 min。先后使用灭菌的ddH2O和10%灭菌甘油洗涤菌体各2次。最后使用1 mL 10%的灭菌甘油悬浮菌体，感受态细胞制备完成。取100 μL的电击感受态细胞于0.5 mL灭菌的EP管，加入1 μg待电转的质粒轻柔混合，将混合物加入到2 mm的Bio-Rad电转化杯中，并于冰上静置10 min，采用Bio-Rad公司的Gene Pulser Xcell电转化仪，将电转化杯置于电击槽中(电击参数2500 V，10 ms，2 mm)开始电击，完成后立即将菌液吸取到3 mL的RM培养基中，30ºC静置恢复培养6 h。将培养物全部离心后悬浮于200 μL的培养基中，涂布于对应的抗生素平板上，30ºC静置培养2-3 d后观察转化结果。 质粒是在DH5α中提取的，浓度70到100ng/μL，每次尽量约1μg。过程中保温我认为也做得比较好。望了解zm4电转化的同学可以给点意见。很少用这个号，没什么金币，望见谅。 |
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