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medicilon

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[交流] CD45分子与艾滋病的关系及抗人CD45抗体哺乳细胞表达载体的构建

CD45是位于白细胞表面的白细胞共同抗原，高水平表达在除红细胞和血小板之外的所有造血细胞上。进行抗人CD45抗体哺乳动物表达载体的构建，并筛选出能稳定高表达抗CD45基因工程抗体的细胞株，可为以人CD45为靶点的研究奠定基础。
CD45分子是T细胞活化所必需的。研究表明TCR或CD3信号刺激不能使CD45表达缺失的T细胞增殖和产生细胞因子，并且在CD45缺陷的小鼠模型中也证明CD45在免疫系统中发挥的重要作用。随着CD45研究的深入，人们发现它与多种疾病如多发性骨髓瘤、艾滋病相关，因此进行抗人CD45抗体的哺乳动物表达载体的构建可以为CD45在自身免疫疾病、免疫缺陷疾病、恶性肿瘤等的诊断、治疗及预后的研究提供了一些方向。
哺乳动物细胞的表达产物在分子结构、理化性质和生物学功能方面最接近天然的高等生物蛋白质分子，可以用于重组蛋白药物和诊断原料试剂盒的开发及应用等。美迪西所提供的哺乳动物蛋白表达系统基于无血清培养体系，可提供基因表达优化、瞬时表达、稳定表达及抗体生产等多种真核蛋白服务项目。美迪西的科研人员建立了成熟的哺乳动物蛋白表达系统及纯化服务平台，提供哺乳动物蛋白表达系统的表达与纯化服务。
1、CD45分子与艾滋病的关系
T细胞是HIV感染的主要靶细胞。在HIV感染时，对T细胞表面分子的变化研究能够进一步阐述HIV的感染机制。研究表明，表达CD45RO的CD4 + T细胞更易于结合HIV-1，而CD45RO-细胞却不能结合，并且与HIV在CD4 + CD45RABC+初始细胞内复制程度相比，HIV更容易在CD4 +CD45RO+ 记忆细胞内复制，当HIV感染CD4 +CD45RO+ 细胞时，CD3/CD28刺激信号引起的细胞核因子反应更强烈，进一步说明HIV在CD45RO+细胞内更易复制。
研究者还发现HIV感染时CD45在T细胞表面的密度减少，CD4 + T细胞上CD45RA和CD45RO 表达降低，CD45RA在CD8 + T细胞上降低，CD45RO在CD8 + T细胞的表达升高，由于CD45基因的多样性，使得表达不同CD45分子的细胞对病毒的易感性有很大差异。例如将编码CD45的外显子进行C77G突变后，CD45的mRNA 会发生异常剪切，最终可增加细胞对HIV的易感性；其他研究也显示CD45的多态性与细胞对HIV的易感性有关，在非洲乌干达人中CD45的第4个外显子有A54G突变，而这种的突变结构降低了HIV的感染频率，这些都证明CD45 与HIV感染密切相关。
HIV感染T细胞后可使细胞发生凋亡，多种机制参与了这一过程，其中包括CD45分子介导的细胞凋亡。由于HIV-1感染T细胞可干扰CD45的酪氨酸磷酸酶活性和PLCγ的功能，对CD45活性的这种影响与疾病进程和细胞凋亡相关。由于HIV潜伏库的存在，当前的AIDS 治疗方法并不能有效完全清楚体能的HIV病毒，而潜伏感染的CD4+T是HIV治疗的主要障碍。HIV主要潜伏在静息的记忆T细胞中，静息记忆T细胞表面标志为CD4 +CD45RO+，故对CD45分子的深入研究可能为清除HIV 潜伏库提供新的思路。
2、抗人CD45哺乳动物表达载体的构建
构建两种新型抗人CD45哺乳动物细胞表达载体，利用DHFR系统筛选出能稳定高表达抗CD45基因工程抗体的细胞株，为以人CD45为靶点的研究奠定基础。方法如下：
(1)PCR扩增得到抗CD45抗体的轻链可变区VL区和重链可变区VH区基因，通过基因工程技术构建抗人CD45抗体的真核表达载体，得到Anti-CD45-scFv-Fc与pBudce-CD45[H+L]。
(2)将两者转染HEK-293T细胞获得瞬时转染表达，用Elisa方法检测两种真核表达载体的抗体表达量的差异。用流式细胞术检测两种抗体与CD45-/+细胞系的结合。
(3)采用抗原抗体系统和生物素亲合素系统Western blot方法，鉴定抗体与CD45分子的结合特异性。
(4)挑选表达量较高，结合活性好以及具有结合特异性的抗体用于后续实验研究。筛选出稳定高表达Anti-CD45-scFv-Fc的DG44-CHO细胞株。
结果发现：
(1)通过分子生物学技术将抗体基因片段分别克隆至载体，得到载体Anti-CD45-scFv-Fc与pBudce-CD45[H+L]，经测序鉴定显示其载体DNA序列正确，表明两种哺乳细胞表达载体均构建成功。
(2)用Elisa方法检测Anti-CD45-scFv-Fc与pBudce-CD45[H+L]两种载体转染HEK-293T细胞后的抗体瞬时表达量分别为2mg/L和0.3mg/L。
(3)采用流式细胞术检测结果表明，Anti-CD45-scFv-Fc载体表达的抗体与CD45+多种细胞株(KG1a,K562,Jurkat)结合活性接近单克隆抗体，而与CD45-的多种细胞株(HepG2,A549,B16,HU)结合活性低。pBudce-CD45[H+L]载体表达量过低，因此选择表达量高的Anti-CD45-scFv-Fc载体用于后序实验。
(4)Western blot鉴定结果表明Anti-CD45-scFv-Fc载体表达的抗体与高表达CD45分子细胞株总蛋白在250kD处有结合条带，符合CD45分子理论值170-250kD，而与不表达CD45分子的细胞株总蛋白在相同位置无结合条带。同时，Anti-CD45-scFv-Fc抗体与生物素标记的人CD45(rhCD45)作用,HRP标记的亲和素显色，还原抗体与非还原抗体分别在约60kD和120 kD处有结合，符合单价抗体(包含Fc段)与双价抗体分子量大小，证实所构建的载体转染哺乳动物细胞成功表达双价抗体，并可与CD45分子的特异性结合，达到了预计形成的抗体结构模式。
(5)用DHFR系统筛选获得了稳定转染Anti-CD45-scFv-Fc的DG44-CHO细胞，并证实了该系统对抗体的结合活性等无明显影响,可大量表达抗体进行后续效应实验。
因此成功改造鼠源性单克隆抗CD45抗体，构建了表达抗人CD45抗体的哺乳细胞表达载体Anti-CD45-scFv-Fc，DHFR系统筛选获得稳定高表达Anti-CD45-scFv-Fc的DG44细胞株。

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