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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 培养/筛选 » 同源重组阳性重组子筛选
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实验室小白

新虫 (正式写手)

[求助] 同源重组阳性重组子筛选 已有1人参与

细菌基因敲除，用同源重组的方法，质粒转进去之后在含抗生素平板上长了非常多菌落，这咋筛呢？想请教各位都是怎么做的呢？一个一个筛？

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1楼 2018-12-12 13:37:31
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1034714749

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
实验设计的时候确定要敲除的基因并设计好同源臂的话，理论上能长出来的是敲除成功的。长满平板的情况不多见。
可以随机选取几个验证一下试试。

另外需要注意细菌来源，野生菌或者没有做过抗性筛选的菌需要注意，菌本身是否具备了抗性，导致在抗性平板上生长
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2楼2018-12-12 15:24:03
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赤月雪

新虫 (小有名气)
用什么质粒敲的，我做只能长出来十几二十，满板子都是，要不就抗生素没用，要不就你转化效率高的不行了

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3楼2018-12-13 15:36:31
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实验室小白

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 1034714749 at 2018-12-12 15:24:03
实验设计的时候确定要敲除的基因并设计好同源臂的话，理论上能长出来的是敲除成功的。长满平板的情况不多见。
可以随机选取几个验证一下试试。

另外需要注意细菌来源，野生菌或者没有做过抗性筛选的菌需要注意， ...

您说的很有道理，按原理来说确实如此，但就是不知为啥能长这么多，我跑抗性基因的pcr确实也都有，不知道下一步该怎么办了，而且设了阴性对照，没转质粒的一个菌落都不长

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4楼2018-12-13 15:55:49
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实验室小白

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 赤月雪 at 2018-12-13 15:36:31
用什么质粒敲的，我做只能长出来十几二十，满板子都是，要不就抗生素没用，要不就你转化效率高的不行了

用的是链球菌的自杀质粒pFW5，设了阴性对照，没转质粒的一个菌落都没长，所以应该不是抗生素的问题，现在不知道下一步应该怎么做了，难过

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5楼2018-12-13 15:56:57
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