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端粒酶酶活性检测分析技术之荧光纳米探针
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研究发现，细胞癌变与衰老受到细胞染色体两端的重复序列端粒长度的控制，而端粒是由端粒酶特异合成。端粒酶存在于85-90%的肿瘤组织中，因此不少生物公司提供的酶活性检测服务可以通过检测端粒酶活性进而早期诊断大多数肿瘤。正常人体细胞中不能检测出端粒酶活性的表达，而肿瘤细胞株及大多数肿瘤组织中的端粒酶活性却异常的高表达。荧光纳米探针可以用于端粒酶活性的荧光检测以及活细胞中端粒酶的原位成像。 酶活力是指专一性催化某种底物反应的能力，酶活力通常用一定条件下酶催化某种反应的反应速度来表示。酶活力的测定在酶性质研究、酶活力学研究及酶制剂水平衡量方面有重要作用。临床前CRO公司美迪西的生物部在体外生物学领域有丰富广泛的经验，通过酶水平测定、细胞水平测定、细胞生物学、生物化学、体外同位素测定、稳定细胞株建立、基因敲除、RNAi和MicroRNA技术等，提供一套完整的生物学服务。 临床检验诊断学领域一直以来将建立性能优异的端粒酶活性检测方法作为重要的研究内容，目前最常用的检测端粒酶活性的方法就是端粒重复片段扩增（TRAP）法，它能利用端粒酶能在底物DNA末端添加不同数量的TTAGGG序列这一特点，通过PCR检测延伸产物而高效检测端粒酶活性。人端粒酶酶活性检测服务常使用端粒重复片段扩增技术服务，是用放射性同位素作为核酸探针传统的标记物。然而总的来说，以TRAP法为基础的各种端粒酶活性分析方法还存在不足。目前还缺乏灵敏度和特异性高，定量准确检测端粒酶活性的方法。建立端粒酶的准确定量系统和量化各种正常与肿瘤组织端粒酶的表达，是在临床应用端粒酶作为肿瘤诊断和判断预后的关键。 荧光生物传感器作为一种简单快速、高灵敏以及特异性好的检测手段，在生物分子的检测中得到了广泛的应用。具有独特光学特性的纳米材料的兴起和纳米技术的快速发展为新型的荧光生物传感器的构建提供了思路,使得纳米荧光生物传感器逐渐成为生物分子检测技术发展的新方向。 有研究者提出了将氧化石墨烯和磷化钴纳米材料作为高效的荧光猝灭剂，利用其大的比表面积、对核酸分子优异的选择性识别功能和良好生物相容性构建了新型的荧光生物传感器用于端粒酶活性的分析。实现对端粒酶活性的荧光检测以及活细胞中端粒酶的原位成像。主要研究如下: 首先构建了基于氧化石墨烯传感平台的荧光纳米探针用于端粒酶活性的分析，实现了快速、灵敏、有选择性的检测端粒酶活性。同时，氧化石墨烯还可以作为荧光探针的载体，对活细胞内端粒酶活性进行分析。没有端粒酶时，荧光探针吸附于氧化石墨烯纳米片的表面，荧光被猝灭；当存在端粒酶时，端粒酶能够触发底物延伸出端粒序列，与荧光探针互补杂交形成稳定的双链DNA，这个过程能够引发荧光探针从氧化石墨烯的表面脱离出来，使得荧光信号恢复。根据荧光信号强度的变化，定量检测细胞提取物中端粒酶的活性。通过共聚焦成像技术，实现对细胞内端粒酶活性的监测。 然后设计了具有特殊序列的发夹荧光探针，结合杂交链式扩增技术和磷化钴纳米线对DNA的选择结合能力和荧光猝灭效应，建立了基于杂交链式放大反应的磷化钴荧光纳米生物传感器检测端粒酶活性。荧光标记的发夹探针HP1与HP2首先吸附在磷化钴纳米线上，在端粒酶的作用下，底物延伸出一段DNA单链，打开发夹探针HP1，释放的HP1单链部分与新的HP2探针末端杂交，触发杂交链式反应，同时吸附在磷化钴纳米线上的荧光基团得到释放，经过多次的杂交链式反应，产生大量增强的荧光信号；没有端粒酶时，HP1的发夹结构不能打开，杂交链式反应不能进行，探针的荧光通过光致电子转移被纳米线高效猝灭，荧光信号强度低。同时研究者还证明磷化钴纳米线生物传感器可应用于原位、实时的对细胞内端粒酶活性进行成像分析。 端粒酶是目前已知的最为广谱的肿瘤分子标记物，并且有可能成为肿瘤治疗的新靶点，因此目前有许多生物技术公司提供端粒酶酶活性检测服务，力求以端粒酶为靶点，发掘端粒酶抑制剂作为治疗肿瘤的有效药物。 |
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