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酵母双杂交技术在筛选抗趋化因子受体4的单链抗体的研究
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趋化因子受体4（CXCR4）在大脑、淋巴结、小肠等组织器官中有广泛的分布，在造血干细胞、T细胞、B细胞、枝状细胞、内皮细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞中均有较高的表达。利用酵母双杂交技术可以从单链抗体文库中筛选抗CXCR4的单链抗体进行研究，酵母双杂交实验服务常包含在一些生物公司提供的研发服务中。 酵母双杂交实验服务一般指的是在酵母体内通过重建有活性转录因子的结构来鉴定蛋白质之间的相互作用，目前已知的蛋白质相互作用至少有一半是通过酵母双杂交实验发现的。酵母双杂交实验服务可以帮助客户研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术服务。美迪西生物医药专业从事酵母双杂交，出具权威检测数据报告，具有独立优质实验室，专业实验人员，提供详细的酵母双杂交实验步骤，原始数据和图片，结果分析。 趋化因子是细胞因子超家族中具有化学趋化性的单链小分子蛋白质（分子量8～10 kDa），能与G蛋白偶联受体结合，不仅参与血管生成、造血、胚胎发育等生理过程，因其能对嗜酸粒细胞、中性粒细胞等多种细胞产生趋化作用，也在机体免疫反应、炎症及肿瘤发生中发挥作用。趋化因子根据半胱氨酸（Cys）残基和二硫键位置的不同分为4个亚类，C亚类（仅有一对二硫键）、CC亚类（二硫键间无氨基酸）、CXC亚类（插入一个氨基酸）和C3XC亚类（插入三个氨基酸残基）。目前共发现50多种趋化因子和20余种趋化因子受体，基质细胞衍生因子-1（SDF-1）及其受体CXCR4就是其中研究较多的两个。 CXCR4属于趋化因子受体CXC亚家族，1996年发现时被命名为Fusin，基因定位于人染色体2q21，是由352个高度保守的氨基酸组成的7次跨膜G蛋白偶联受体，通过胞外N端与配体SDF-1结合并启动下游信号通路。CXCR4主要表达在外周血淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、树突状细胞、血管内皮细胞、神经元、肝脏干细胞等，可以非特异地与糖蛋白的硫酸肝素结合到细胞表面。 CXCR4是肿瘤细胞上普遍存在的趋化因子受体，人类至少有23种血液瘤和实体瘤细胞高表达CXCR4，包括乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、非霍奇淋巴瘤等，因此CXCR4高表达可以作为恶性上皮细胞肿瘤的一项特征指标。此外，CXCR4的激活会促进癌细胞的定向迁移，并增加对内皮细胞、骨髓干细胞和纤维原细胞的侵染性。利用酵母双杂交技术筛选抗CXCR4的单链抗体，并将筛选的单链抗体进行蛋白纯化，为研究这些单链抗体在体内外的抗肿瘤活性奠定基础。 首先构建酵母双杂交体系中的诱饵质粒pGBKT7-CXCR4，将其转化到酵母菌株AH109内，在含有营养缺陷型的培养基中检测其自激活。将单链抗体文库转化到含有诱饵质粒的AH109内，并在SD/-Trp/-leu/-His+10mM3-AT培养板上对抗体文库进行筛选。将生长的候选阳性克隆在SD/-Trp/-leu/-His/-Ade+10mM3-AT培养板上进行划线筛选，将筛选的克隆分别回转到含有对照载体pGBKT7、含有对应抗原pGBKT7-CXCR4、以及含有无关抗原的AH109内。 经过筛选将最终得到的阳性克隆进行DNA测序及其分析。将单链抗体基因克隆到表达载体pET-28a-sumo内，将其转化到BL21菌体中进行包涵体蛋白纯化。采用ELISA技术检测纯化后的单链抗体与抗原CXCR4的结合能力。结果发现： (1)构建的诱饵质粒pGBKT7-CXCR4没有自激活作用。 (2)采用CXCR4作为抗原筛选单链抗体文库，利用酵母双杂交技术最终筛选得到3个阳性单链抗体克隆，经过DNA序列分析确定为3个人的单链抗体，分别为aCX73、aCX82、aCX136。(3)将3个单链抗体基因克隆到表达载体pET-28a-sumo内，将其转化到BL21菌体内进行包涵体纯化，成功地纯化了其中2个单链抗体(aCX73、aCX82)。 (4)采用ELISA检测表明:这2个单链抗体和抗原CXCR4具有较强的结合能力，可以用于将来的抗癌实验研究。 因此应用酵母双杂交技术从单链抗体文库中筛选到了抗CXCR4的单链抗体a CX73、aCX82、aCX136，纯化的aCX73、aCX82与抗原CXCR具有较强的结合能力，为将来一步研究这些单链抗体在体内外抗癌的研究奠定了较好的基础。 |
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