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重组蛋白分离纯化技术之离子交换层析法的应用
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离子交换层析法是重组蛋白纯化的一种方法，是利用一些带离子基团的纤维素或凝胶，吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原，将蛋白质抗原按带电荷不同或量的差异分成不同的组分。作为重组蛋白纯化常用的一种层析方法，离子交换层析法具有灵敏度高、重复性和选择性好和分析速度快等优点。 重组蛋白技术是获得大量蛋白质的主要手段，重组蛋白表达和重组蛋白纯化可以探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，并作供作结构与功能的研究。美迪西生物医药在重组蛋白表达与纯化服务方面有10余年经验积累，美迪西生物医药拥有多种蛋白表达系统，包括原核蛋白表达系统、酵母蛋白表达系统、昆虫细胞蛋白表达系统（杆状病毒）哺乳动物细胞蛋白表达系统，具备多种融合技术，可以为客户在蛋白表达与纯化方面提供多种选择。 1、离子交换层析法的基本原理 若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与H+发生交换而结合在树脂上。若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物质可与OH-发生交换而结合在树脂上。物质在树脂上结合的牢固程度有差异，选用适当的洗脱液可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。 （1）平衡阶段：离子交换剂与反离子结合； （2）吸附阶段：样品与反离子进行交换； （3）解吸附阶段：梯度缓冲溶液先洗下吸附物质，后洗下强吸附物质； （4）再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤，即可重复使用。 2、离子交换层析获得人凝血因子和分离人结合珠蛋白的应用 （1）离子交换层析法获得人凝血因子的应用 人凝血因子Ⅷ，作为治疗凝血障碍性疾病血友病A的唯一有效用药，主要有两个，一是血浆离心后获得的冷沉淀中分离的人凝血因子Ⅷ，二是通过基因改造获得的重组人凝血因子Ⅷ。可以建立一种离子交换层析结合病毒灭活方式获得人凝血因子Ⅷ(FⅧ)的方法，并筛选其保护剂配方。 方法是采用聚乙二醇沉淀法及离子交换层析法对血浆来源的冷沉淀进行纯化，经S/D和80℃72 h干热两步病毒灭活法进行病毒灭活，验证灭活效果，并筛选最佳保护剂配方。结果发现聚乙二醇沉淀后的FⅧ纯度较新鲜血浆提高了约110倍，离子交换层析纯化后FⅧ纯度提高30倍以上；S/D和80℃72 h干热法的灭活效果良好。最佳保护剂配方为0.01 mol/L枸橼酸钠、0.001 mol/L氯化钙、8 mg/ml白蛋白和40 mg/ml盐酸精氨酸。 结论该方法可制备纯度较高、稳定性和安全性较好的FⅧ制品，确定的保护剂配方对干热灭活的耐受性良好。 （2）离子交换层析法分离人结合珠蛋白的方法 结合珠蛋白（haptoglobin，HP）又称触珠蛋白，是一种分子量为85000的酸性糖蛋白，广泛存在于人类和多种哺乳动物的血清及其他体液中，其主要功能是与游离血红蛋白结合成稳定的复合物，然后被单核—巨噬细胞系统处理掉。Hp具有非特异性免疫防御功能，可以抑制流感病毒的血凝集反应，对那些生长和繁殖过程中需要亚铁血红素的致病菌也有抑制作用。此外Hp还是前列腺素合成酶复合物的内源性抑制物。 可以应用离子交换层析从Cohn组分Ⅳ分离纯化人结合珠蛋白(haptoglobin,Hp)，并对纯化产物进行初步鉴定及活性分析。方法是 Cohn组分Ⅳ溶解液稀释后经利凡诺络合，收集上清并用50%硫酸铵进行沉淀，沉淀重溶后用Q Sepharose Fast Flow层析分离纯化得到目的蛋白。然后利用SDS-PAGE及免疫印迹对目的蛋白进行鉴定，并利用Native-PAGE方法测定纯化产物的活性。结果 Cohn组分Ⅳ经过利凡诺络合及盐析处理后能有效去除部分杂蛋白,并使目的蛋白富集。 利用离子交换层析方法从Cohn组分Ⅳ中纯化得到的主要产物为Hp2-2，SDS-PAGE显示Hp纯度较好，免疫印迹分析进一步证明，利用该法成功分离得到目的蛋白Hp，且利用NativePAGE方法测得目的蛋白活性为2.8 U/ml。因此利用该法从Cohn组分Ⅳ中成功分离得到人Hp，方法简单，易于放大生产，具有较好应用前景。 离子交换层析方法只是重组蛋白纯化的方法之一，目前对于重组蛋白纯化，只能针对某一种或某一类蛋白结合不同的纯化方法得到较纯、活性较高的产品。随着科技的进步，基因工程产品的分离纯化必定会变得越来越简单，成本也会越来越低，效率更高，操作更容易。 |
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