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浅析酵母双杂交技术在发现蛋白质新功能上的应用
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细胞或组织的蛋白质不是杂乱无章的混合物，蛋白质间的相互作用、相互协调是细胞进行一切代谢活动的基础。酵母双杂交技术不仅可以研究蛋白质间相互作用，还可以发现蛋白质的新功能，许多生物公司提供酵母双杂交服务。酵母双杂交服务一般包括酵母双杂交文库构建、文库筛选、相互作用验证等方面服务。 酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到。美迪西生物医药提供酵母双杂交服务，其可以出具权威检测数据报告，具有独立优质实验室，专业实验人员，提供详细的酵母双杂交实验步骤，原始数据和图片，结果分析。 酵母双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识，细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。80年代的工作表明，转录激活因子在结构上是组件式的(modular)， 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中有DNA结合结构域(DNA binding domain, 简称为DB)和转录激活结构域(activation domain, 简称为AD)，它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DB虽然能和启动子结合，但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。如酵母细胞的Gal4蛋白的DB与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录。 酵母双杂交技术已经成为发现新基因的主要途径，将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-LIBRARY载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。另外，也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之间功能相关的主要方法。 1、酵母双杂交技术在与人神经末端蛋白相互作用的新蛋白的研究 例如，研究者Engelender等人以神经末端蛋白alpha-synuclein 蛋白为诱饵蛋白，利用酵母双杂交CLONTECH MATCHMARKER SYSTEM 3为操作平台，从成人脑cDNA文库中发现了与alpha-synuclein相互作用的新蛋白Synphilin-1，并证明了Synphilin-1与alpha-synuclein 之间的相互作用与帕金森病的发病密切相关。 为了研究2个蛋白之间相互作用的结合位点，找到影响或抑制2个蛋白相互作用的因素，Michael等人又利用酵母双杂交技术和基因修饰证明了alpha-synuclein的1~65个氨基酸残基和Synphilin-1的349~555个氨基酸残基之间是相互作用的位点。研究它们之间的相互作用位点有利于基因治疗药物的开发。 2、酵母双杂交技术在发现和筛选靶蛋白上的研究 Fromont-Racine等人以10种功能已知的与mRNA前体剪接有关的蛋白质作起始“诱饵”，从含有约5×106个克隆的酿酒酵母基因组文库中进行第一轮筛选(这些基因组DNA与AD的基因融合构成“猎物”表达载体)。经过对阳性克隆“猎物”DNA的序列分析，他们把这些DNA分成两大类共5项：编码蛋白质的DNA和非编码蛋白质的DNA。 编码蛋白质的DNA分为4类，A1是在序列上彼此有部分重叠的克隆群，这一项也是首先分析考虑的对象； A2和A3分别是靠近ORF起始密码子的编码蛋白质N-末端的片段和ORF内部的大编码片段，A4是其他的编码序列。这四项优先考虑的顺序是： A1>A2>A3>A4。 根据分析把从中得到的4种靶蛋白做成新的“诱饵”进行第二轮筛选，再把从中得到的一种“猎物”做成“诱饵”进行第三轮筛选。如此经过3轮共15次筛选，他们从中共得到约700个阳性克隆并且对大多数作了部分测序。这些筛选到的靶蛋白中，有9种是已知的mRNA前体剪接因子，5种是新发现的剪接因子，8种是与RNA其他加工过程有关的因子，还有45种与其他的功能有关。 另外有9种是转录激活因子，这主要来自假阳性克隆。他们不仅发现了已知剪接因子与其他因子的相互作用，鉴定了一些新的因子，而且建立了这个剪接途径与其他代谢途径的联系。研究人员表示如果选择不同的细胞代谢或信号转导途径为出发点，通过类似的双杂交实验最终有可能建立酵母细胞完整的蛋白质联系图谱。推而广之，这项技术同样也能用到人类蛋白质组研究中。 目前，酵母双杂交技术已经在蛋白质间的相互作用研究、筛选新的蛋白质、研究蛋白质的功能等方面发挥着重要作用。虽然酵母双杂交技术存在假阳性和假阴性等结果，然而该项技术已经成为许多实验室研究蛋白质的相互作用和蛋白质新功能的必要手段。 |
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