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yingzi_no1

银虫 (初入文坛)

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注册: 2009-04-07
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专业: 兽医免疫学

[交流] 鸭瘟病毒基因组抽提-请各位帮忙

[各位大侠，我是个新手。目前正在抽提鸭瘟病毒基因组DNA，但抽提后电泳无条带（MAKER亮且宽，靠近点样孔），下面是我的protocol：

1、将在DEF上增殖收获的病毒液200ml，反复冻融3次，5000r/min 20min,10000r/min 30min差速离心，取上清。
2、5ml30%蔗糖垫底，45000r/min 2.5h超离(超离后沉淀略带黑色，是不是蔗糖有问题？)。
3、沉淀悬浮于高渗液C1（1.28mol/LSucrose,20mmol/LMgcl2,40mmol/LTris-Hcl,4%Triton-100)，冰浴10min。（为了保证较高的病毒粒子浓度，我只用了100ul左右的高渗液C1悬浮沉淀，吹打时见有多量泡沫）
4、10000r/min 30min，取上清。
5、加400ul胞核缓冲液（10mmol/LTris-Hcl,,2mmol/LMgcl2,10%Sucrose）。
6、加500ul消化缓冲液（10mmol/LNacl,10mmol/LTris-Hcl.25mmol/LEDTA,0.5%SDS），蛋白酶K40ul，50°C过夜。
7、PC抽提（只见两层，未见有蛋白质层，好像应该有三层？），重复一次。氯仿抽提一次。
8、等体积异戊醇，-20°C45min。
9、4°C13000r/min 10min取上清。加50ulKAc和1ml冷无水乙醇-20°C沉淀2h。
10、10000r/min 30min，倒掉上清。70%冷乙醇洗两次。10000r/min 10min（沉淀和洗涤后均未见有沉淀）。
11、加含1ulRNase的TE100ul。
12、9ul样品1ulLoading buffer0.8%agrose 80V 40min。

Question:电泳后除了Marker有条带，其他点样孔都没有条带。请问是因为我的病毒液不够导致浓缩后DNA浓度仍然达不到电泳所需的浓度才无条带吗？如果是因为这个原因，那我应该浓缩多少的病毒原液才足够电泳呢？如果不是浓缩的原因，请各位看一下，是我在上面的哪一步把病毒粒子丢失了吗？或者是因为超离后我所加的悬浮沉淀的液体太少导致病毒粒子未全部悬浮而丢失？还是我在其他哪一步出了问题？

PS:我抽提病毒基因组的目的是为了做酶切图谱。

由于实验室没人做过这方面的实验，交流有限，本人的实验一直搁置，请各位大侠不吝赐教，不胜感激！Sample Text Sample TextSample TextSample Text

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