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细胞株蛋白的作用及相互作用蛋白筛选研究
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细胞株蛋白（Cytoglobin,Cygb）是一种细胞内抗氧化蛋白，是最近发现的脊椎动物珠蛋白超家族中的一员，它具有保护细胞、抑制肿瘤细胞增长的功能。进行酵母双杂交文库构建，筛选出与CYGB相互作用的蛋白，为进一步研究CYGB的功能机制奠定基础。酵母双杂交文库构建是筛库的前提，可用于目的蛋白的互作蛋白大规模筛选分析蛋白质间的相互作用，是现在分子生物学与生物化学常用的手段。 酵母双杂交技术是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术，最大的优点就是不需要分离纯化蛋白质，整个过程只是对核酸进行操作，同时充分利用酵母生长速度快、易于操作等特点，酵母双杂交文库构建一般包括核体系和膜体系两种方法。美迪西提供酵母双杂交服务，具有独立优质实验室，专业实验人员，提供详细的酵母双杂交实验步骤、原始数据和图片、结果分析，可以出具权威检测数据报告。 细胞株蛋白最初由日本Tawada等在2001年在大鼠纤维化肝脏的星状细胞中发现了此种蛋白。由于其具有紧凑的螺旋形结构和结合血红素的能力，可可逆的结合各类气体分子，如氧气、一氧化氮等。Cygb在缺氧时表达上调且特定地表达在毛细血管周围，提示其可能具有氧感受器的作用。Cybd可以作为清道夫，清除组织缺血后再灌注时产生的ROS和NO分子。此外它还具有过氧化氢酶活性，在肝星状细胞中其过氧化物清除剂的作用。研究显示，Cygb对肝纤维化的逆转有着非常显著的作用。 Cygb具有预防肝纤维化、实现肝纤维化逆转的功能，且其作用是通过调控HSC的激活状态实现的，与肝脏中细胞及细胞外基质间的氧化应激密切相关。有研究者选取了两种肝脏中有代表性的氧化模型，过氧化氢模型及铁过载模型，系统性研究了Cygb在肝纤维化氧化应激中发挥的具体作用，并结合microRNA(miRNA)技术，初步探索了Cygb在肝星状细胞激活时表达上调的可能性机制。该研究为全面阐释Cygb这一治疗基因的抗氧化作用及机制、加速药物新靶点开发提供了理论依据。 有研究者通过酵母双杂交筛选出17个与Cygb相互作用的蛋白，环指蛋白2(RNF2)是其中之一，为进一步研究Cygb的功能机制奠定基础。首先进行酵母双杂交文库构建，筛选Mate & PlateTM Library-Universal Human (Normalized)人源标准化cDNA文库，寻找与Cygb相互作用的蛋白，然后研究者通过酵母回复性杂交实验和免疫共沉淀实验进一步验证Cygb与RNF2之间的相互作用。 环指蛋白2(RNF2)属于多梳家族，是多梳抑制复合物1(PRC1)中的一员。RNF2可以介导组蛋白H2A的泛素化，因此RNF2在多梳结构介导的基因抑制中发挥重要作用。RNF2作为PRC1家族的一员，在胃癌、结肠癌、淋巴癌等多种癌症中高表达。RNF2具有原癌基因的活性，敲除RNF2的HeLa细胞形态会发生改变，,细胞增殖也会受到抑制。RNF2是一种E3连接酶，与P53具有直接的相互作用，在人结肠癌HCT1 16细胞系中它可以以p53为靶点通过蛋白酶体途径，促进p53的降解，从而影响P53下游基因的表达水平，以调节细胞周期和细胞凋亡。 据此研究者推测Cygb与RNF2之间的相互作用很可能与肿瘤的发生发展具有一定的关联性。该研究具有以下作用: （1）成功构建了pGBKT7-Cygb重组表达载体，该重组质粒在Y2H Gold酵母菌株成功表达BD-Cygb-MYC融合蛋白，且Cygb诱饵蛋白对Y2H Gold酵母细胞无毒性作用、无自激活活性。实验结果表明，pGBKT7-Cygb酵母诱饵表达载体构建成功，可以用于文库筛选。 （2）以pGBKT7-Cygb重组质粒为诱饵从Mate & PlateTM Library-Universal Human (Normalized)文库中筛选CYGB的相互作用蛋白，最终得到32个蓝色的阳性克隆。阳性克隆质粒的PCR产物经测序鉴定、比对初步得到了17个细胞珠蛋白的相互作用基因。其中RNF2、SLC7A13、ATP1B1这三个基因重复出现多次。RNF2基因一共重复出现11次，并且与癌症相关，是研究者们验证和深入研究的重点。 （3）经酵母回复性杂交实验证明在酵母中RNF2确实能与Cygb发生相互作用。经免疫共沉淀实验证明RNF2和Cygb在HEK293T细胞中发生了相互作用。 （4）在人结肠癌HCT116细胞中，Cygb过表达可以提高RNF2的mRNA水平，降低P53和P21的mRNA水平。提示Cygb很可能正向调控RNF2，从而影响肿瘤的发生发展。 通过酵母双杂交系统筛选出与细胞株蛋白相互作用蛋白的研究，为进一步加深对细胞株蛋白生物学功能的认识，和为治疗肝纤维化等疾病提供坚实的理论基础。 |
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